基于生物信息学分析CDH6基因在胃癌组织中的表达及临床意义

孟静静 崔 敏 周而乐 李 红 曹 璋＊

（1.滨州医学院病理学教研室，山东 滨州 256603；2.滨州市人民医院小儿科，山东 滨州 256600）

0 引言

钙粘附素(Cadherin，CDH)是一种跨膜糖蛋白，负责细胞间的粘附和维持正常的组织结构。经典的钙粘附素是一类通过细胞质结构域与连环蛋白相互作用的粘附分子，包括上皮钙粘附素、神经钙粘附素和胎盘钙粘附素等。研究证实，CDH的异常表达与多种癌症的发生发展密切相关，如CDH1的表达缺失在上皮间充质转化和增加肿瘤细胞的迁移和侵袭行为中起着重要的作用；CDH3的过度表达与乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌和胃癌预后不良之间存在显著相关性。

K-钙粘附素（K-Cadherin，CDH6）是钙粘附素家族的成员之一。最近的研究表明，CDH6在多种癌症中被异常激活。例如，CDH6在骨肉瘤患者中表达上调，并与骨肉瘤患者的整体生存和不良预后密切相关；CDH6是甲状腺肿瘤侵袭性的潜在调节因子，在具有间充质特征和侵袭性表型的甲状腺肿瘤细胞中高表达。CDH6的表达与多种肿瘤的发生发展密切相关，然而其与胃癌发生发展的关系却未见报道。本研究拟采用多种生物信息学分析技术，对CDH6在胃癌中的表达情况及功能进行分析和预测。

1 材料与方法

1.1 数据下载与整理

本研究分析的所用数据均来自公共数据库，通过TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）检索并下载TCGA-STAD项目下的包含30例正常组织和343例胃癌组织的RNA转录本数据，及406例胃癌患者的临床数据，依据样本ID标识符，鉴定出25对胃癌组织及与之匹配的癌旁组织样本。使用R软件中的“limma”函数包对所有RNA转录本数据进行处理。根据样本ID将临床数据与RNA转录本数据合并。

1.2 不同组间CDH6表达水平对比分析

根据不同临床参数（如正常组织与肿瘤组织、年龄、性别、组织学分级、临床分期、TNM分期）进行分组，使用SPSS软件分析不同组间CDH6的表达水平。

1.3 临床数据及CDH6表达与预后关系分析

使用R软件中的“survival”与“survminer”函数包进行单因素和多因素Cox归分析，评价CDH6及其他临床参数对胃癌预后的影响，同时进行Kaplan-Meier生存曲线的绘制，分析CDH6高低表达组样本间总生存期的差异。

1.4 CDH6共表达基因的功能分析

使用cBioPortal平台（http://www.cbioportal.org/）分析Stomach Adenocarcinoma（TCGA，PanCancer Atlas）数据集中CDH6与其他基因的共表达情况，将|R|≥0.6和P＜0.05作为筛选标准，筛选与CDH6存在共表达关系的基因。使用Metascape（https://metascape.org/）对CDH6及CDH6共表达的基因进行GO和KEGG富集分析，将Min Overlap设置为3，P Value Cutoff设置为0.01，Min Enrichment设置为1.5，推测CDH6在胃癌中的相关功能和途径。

1.5 CDH6高和低表达组的基因集富集分析(GSEA)

以分子签名数据库（MSigDB）中的h（h.all.v7.2.symbols.gmt）作为参考基因集，使用GSEA4.1.0分析CDH6高低表达组样本间生物功能的差异。FDR＜0.25且P＜0.05作为筛选标准，用于筛选显著富集的标志基因集。

1.6 CDH6与肿瘤免疫相关性的分析

CIBERSORT是一种使用基因表达数据来估计混合细胞群中免疫细胞组成的分析工具。使用R软件的“CIBERSORT”函数包评估所有样本中22种免疫细胞的组分；“reshape2”与“ggpubr”函数包分析正常组织与肿瘤组织间22种免疫细胞组分的差异。利用TIMER在线数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析CDH6与胃癌中多种免疫细胞之间的关系。根据之前相关文献的研究，利用TIMER在线数据库分析CDH6与20种潜在靶向免疫检查点基因之间的关系。

1.7 统计分析

使用R 4.0.2软件、IBM SPSS Statistics 25.0软件、GraphPad Prism 8.3.0软件和Adobe Photoshop CC软件进行图表绘制及统计分析。随访＜30天且临床资料未知或不完整的患者被排除在采纳数据的标准之外。根据CDH6表达量的中位数将所有样本分为CDH6高表达组与CDH6低表达组，组间差异采用Student’s t检验和Wilcoxon检验。单因素分析确定的变量P＜0.05作为多因素Cox分析的候选变量。

丁主任顿了半响，扶起甲洛洛：张大爷，虽然你拿了营业部的东西，但你也是为了救人，将功赎罪，应该不会被判刑。嘎绒有些疑惑地看着丁主任：主任，我们私了不行吗？报案对谁都没什么好处。西西一下坐直了身子，看看嘎绒，又看看丁主任：如果可以，营业部丢失的东西我们一起赔。梨花赶紧擦干眼泪：我所有的工资都可以抵账。

2 结果

2.1 CDH6在胃癌中高表达

通过分析TCGA数据库下载的样本数据，与正常组织相比，胃癌组织中CDH6的表达明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.05），分析比较CDH6的表达与胃癌不同临床参数的关系，结果显示，CDH6的表达水平与胃癌的T分期显著相关（P＜0.05），而与其他临床病理参数无显著相关性（P＞0.05）。

2.2 CDH6高表达与胃癌的不良预后相关

通过进行单因素和多因素的Cox回归分析，单因素Cox回归结果显示，CDH6高表达与较差的预后相关（HR=1.362，95%CI:1.110-1.671，P=0.003），调整其他因素后，进行的多因素Cox回归结果显示，CDH6的高表达是胃癌不良预后的独立危险因素（HR=1.405，95%CI:1.126-1.753，P=0.003）。对CDH6高低表达组进行的Kaplan-Meier生存分析显示，CDH6高表达组胃癌患者的预后较差（P＜0.001）。

2.3 CDH6及共表达基因的富集分析

Metascape对CDH6及与CDH6存在共表达关系的基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，主要富集的GO生物过程是血管发育、细胞—基质粘附、与分化有关的细胞形态发生、细胞外基质组织、循环系统过程等；主要富集的GO分子功能是钙离子结合、细胞外基质结构成分、生长因子结合、肌醇-1，4，5-三磷酸结合、血小板源性生长因子受体结合等；主要富集的GO细胞成分是细胞外基质、细胞间连接、细胞皮层、参与细胞粘附的蛋白质复合物、膜筏等。主要富集的KEGG通路基因集是焦点粘连、cGMP-PKG信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、Rap1信号通路、钙信号通路等。

2.4 CDH6高表达与上皮间充质转化相关

通过对CDH6高低表达组进行标志基因集的GSEA分析，结果显示，主要富集的前五位基因集为上皮间充质转化、凝血、血管生成、Hedgehog信号、肌细胞发生。

2.5 CDH6与胃癌免疫细胞浸润正相关

使用“CIBERSORT”对所有样本进行免疫细胞浸润的分析。分析结果显示，与正常组织相比，胃癌组织中M0型巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞、幼稚B细胞、活化CD4+记忆T细胞和滤泡辅助T细胞的比例明显上调（P＜0.05）。TIMER数据库的分析结果显示，CDH6的高表达与胃癌中巨噬细胞、CD4+T细胞等多种免疫细胞的上调正相关（P＜0.05）。

3 讨论

经典的钙粘附素是一类通过细胞质结构域与连环蛋白相互作用的黏附分子，包括了很多亚群，经典的钙粘附素有上皮钙粘附素、胎盘钙粘附素和神经钙粘附素。这些钙粘附素与多种癌症的发生发展密切相关。有研究发现，E-钙粘附素通过限制活性氧介导的凋亡，在乳腺浸润性导管癌侵袭、转移过程中发挥着重要作用，E-钙粘附素表达缺失会导致EMT过程的发生。N-钙粘附素的异常表达与血管生成、黏附和侵袭等多种肿瘤转移过程相关。此外，癌症患者血清中可溶性N-钙粘附素的表达与预后不良密切相关。

CDH6是一种II型钙粘附素，是钙粘附素家族的成员之一。CDH6首先在间充质聚集体和肾囊泡中被检测到，并发现其可能诱导间充质细胞的早期聚集随后上皮细胞的转化，还有研究证实，CDH6在限制性菱形体以及神经板和神经管的其他亚区存在瞬时表达，提示可能在中枢系统的早期发育中发挥作用。近年来，越来越多的研究表明，CDH6的表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。在甲状腺癌中，转化生长因子β（Transforming Growth Factor Beta 1，TGF-β）可以靶向调控CDH6，使CDH6在具有间充质特征和侵袭性表型的甲状腺肿瘤中高表达。EBV病毒的感染可以导致CDH6激活，进而诱导鼻咽癌的EMT过程并促进鼻咽癌的侵袭和转移；CDH6在卵巢癌和肾癌中也存在明显高表达，CDH6在胃癌中的表达情况及功能尚未报道。

通过对公共数据库的样本进行生物信息学分析，可以发现CDH6在胃癌中高表达，其表达的差异影响着胃癌肿瘤的大小及浸润深度，是胃癌不良预后的独立危险因素。CDH6及其共表达基因的GO富集分析结果提示，CDH6可能通过影响肌醇-1，4，5-三磷酸结合、细胞-基质粘附等进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移。CDH6及其共表达基因的KEGG通路富集分析结果提示，CDH6可能通过影响焦点粘连、cGMP-PKG信号通路、Rap1信号通路、钙通道活动、细胞粘附分子功能直接或间接地控制肿瘤细胞的粘附、迁移等活动。虽然GO富集分析显示CDH6的高表达可能影响细胞迁移的正向调节过程，但CDH6表达与临床病理参数的分析显示，CDH6的高表达未显示出促进胃癌的淋巴转移及远处转移，肿瘤转移是受多种基因和信号转导通路的调控的，相关机制还有待进一步研究。

肿瘤的发生发展过程伴随着长期的、无法消除的炎症反应，这种反应由局部细胞因子风暴推动。EMT可以使分化的上皮细胞转化为间充质细胞，在肿瘤的这场局部细胞因子风暴中发挥着重要的作用，影响肿瘤的进展、侵袭和转移，肿瘤部位的炎性细胞会不断产生EMT诱导因子，诱发肿瘤细胞的EMT过程。有研究发现，巨噬细胞在实验中可以通过IL-8依赖的方式诱导肝细胞癌细胞的EMT过程。巨噬细胞还可以通过表皮生长因子诱导非小细胞肺癌细胞EMT过程的发生。此外，大量CD33阳性髓系细胞浸润的三阴性乳腺癌更容易出现EMT征象。在本研究中，笔者试图探究胃癌中CDH6与EMT和免疫细胞之间的关系。GSEA富集分析的结果显示，CDH6高表达组主要富集的标志基因集有EMT和Hedgehog信号等。有研究证实，Hedgehog信号参与调控EMT过程，促进胃癌细胞的侵袭和迁移能力。CDH6可能通过促进胃癌的EMT过程来影响胃癌的进展与预后。本研究观察到CDH6的高表达与胃癌中巨噬细胞、CD4+T细胞、树突状细胞等多种免疫细胞的上调存在相关性，其中相关系数最高的是巨噬细胞。结合CDH6与CD68、CD163共表达关系的结果与免疫细胞浸润分析的结果，巨噬细胞在胃癌中上调，并且以M2型巨噬细胞上调为主。之前的研究证明，肿瘤浸润巨噬细胞（TAMs）中M2型巨噬细胞会促进细胞外基质重构、血管生成、免疫抑制，并通过分泌各种可溶性因子促进癌细胞获得侵袭特性。在许多独立研究中，TAMs被描述为有效的EMT诱导剂，TAM相应地产生多种生长因子，进而诱导肿瘤细胞EMT过程的发生，而M2型巨噬细胞与肿瘤细胞共培养实验证实其促进肿瘤细胞获得EMT的能力。由此推测，在胃癌中CDH6可能被TAMs产生的TGF-β等因子靶向上调，进而促进了胃癌细胞的EMT过程，最终影响胃癌的进展与预后。

本研究中，胃癌中CDH6的高表达与PDL2、TGFβ、HAVCR2和TNFSF4等多个常见免疫检查点和免疫相关用药靶点的高表达存在正相关关系。在多种肿瘤中，EMT评分与免疫检查点基因的表达呈高度正相关。因此，CDH6可能成为预测胃癌免疫治疗应答率的潜在靶标基因，为胃癌患者从免疫治疗中更好地获益。

在本研究中CDH6在胃癌中呈高表达状态，增加了胃癌细胞的侵袭性，笔者推测CDH6可能被TGF-β等因子调控进而通过EMT过程来影响胃癌的进展与预后，CDH6的表达还与多个免疫相关靶点相关。以上结果是根据生物信息学分析结果推测的结论，还需通过体内体外实验来对结论进行验证。综合本研究结果，针对CDH6表达情况对胃癌患者选择个性化的免疫治疗或研发靶向沉默CDH6的药物，都可能为胃癌的治疗提供新思路。