一种从废啤酒酵母中生产β-D-葡聚糖和甘露聚糖的新方法

周 蕊

(陕西国际商贸学院，陕西 咸阳712046)

0 概述

酵母多糖是从酵母细胞壁中提取的大分子碳水化合物的聚合物，主要成分是β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖包括（1,3）β-D-葡聚糖与少量的（1,6）连接葡萄糖和其他支链[1]。甘露聚糖通常以共价键和蛋白质结合，称为甘露糖蛋白[2]。

β-D-葡聚糖通常称为生物反应调节剂（BRM）[3]。β-D-葡聚糖可以作为免疫应答，抗癌，造血调控，保肝，降低胆固醇以及降血糖活性[4,5-8]。β-D-葡聚糖也有抗氧化的作用和能会加速伤口愈合的作用[9,10]。细胞壁甘露聚糖也有粘接性能[11]和抗原变异[12]。鉴于多糖以上所有的特性和用途，前人已有很多研究。但是大多数都是β-D-葡聚糖和甘露聚糖单独提取。我们提出了一个同时生产两种产品的新方法。这个方法过程简单，高效和易于转换到大规模生产。

生产过程见图1。

图1 废酵母中β-D-葡聚糖和甘露聚糖的制备方法

1 实验

1.1 实验材料

固体含量为25%废酵母泥：南京同凯兆业生物技术有限公司提供。酶:沈阳诺维信生物技术有限公司。试剂均为国产分析纯。

1.2 分析方法

1.2.1 多糖的含量测定采用苯酚硫酸法-与6%的苯酚浓度测定，于490nm紫外吸收处测定总糖，分别用葡萄糖和甘露糖为标准曲线定量[13]。

1.2.2 蛋白质的测定通过凯氏定氮分析仪测定总氮（福斯特卡托，公司，瑞典）根据AOAC正式方法。由总氮含量乘以6.25计算蛋白质含量。

1.2.3 灰分的测定

干燥后的样品在600℃焚烧炉中测定灰分（林德伯格/蓝色M，美国）[14]。

1.2.4 含盐量的测定

用硝酸银滴定法测定盐，用作指示剂铬酸钾。

1.2.5 红外光谱

β-D-葡聚糖和甘露聚糖红外光谱分析在Nicolet 380光谱仪中进行（热电，美国）。样品KBr压片近似重量比为1:100[15]。

1.3 过程

1.3.1 预处理

由于废啤酒酵母浆包含一些杂质和无机离子。预处理是用蒸馏水洗涤混合物（300g）在室温下以5000 rpm搅动两次，每次维持10分钟。每次洗涤后放置在温度4℃下冰箱中备用。

1.3.2 超声处理

预处理后的酵母细胞壁是加入0.02M柠檬酸盐缓冲液（添加碱调整到pH=7.2）得到的悬浮液中固体含量为15%。在室温下在超声波细胞破碎仪中（jy92-ⅡDN新芝生物科技有限公司，宁波）进行超声，程序设计为超声2s停2s持续10分钟。

1.3.3 高温高压提取

超声后将悬浮液放入压力为0.1MPa在高压蒸汽灭菌器中高压灭菌90min，温度为121℃后冷却到30℃。不溶性残留物通过离心分离，并将柠檬酸盐缓冲液与上清液（SUP）结合，存储在4℃下。沉积物（SED）被用来提取β-D-葡聚糖。

1.3.4 β-D-葡聚糖的提取

（1）碱处理。

通过正交法L9（34）优化提取条件。九种提取物分别在提取温度为50℃,55℃和60℃，提取时间分别为2h、3h、4h，固液比为1/3，1/4，1/5（W/V）和NaOH浓度为2%，3%，4%下进行。表1显示了实验条件为β-葡聚糖的提取啤酒废酵母泥300g，其中含有78.42%的水分。混合后冷却到室温，不溶性残留物在室温15min 5000rpm条件下被离心分离，用蒸馏水洗涤两次。丢弃上清液和收集沉淀物。

表1 正交试验因素水平

（2）蛋白酶处理

碱处理后用不同的酶酶解，目的是降低蛋白质含量和纯化多糖。用水稀释得到的悬浮液含有15%（W/W）的固体含量。分别用木瓜蛋白酶（P1），复合酶（P2）和中性蛋白酶（N）在各自的最佳条件酶解后，悬浮液5000rpm离心10min。丢弃上清液，收集湿产物。

（3）洗涤和干燥

湿β-D-葡聚糖悬浮在95%乙醇混悬液中搅拌3h，然后离心弃上清。用乙醇冲洗两遍，在60℃下干燥。

1.3.5 提取甘露聚糖

（1）浓度

在50℃-60℃下，在旋转蒸发器（re-52，中国上海中国生化仪器厂）超浓缩至原体积的1/2-1/3。完成后溶液冷却至室温。

（2）透析

在室温条件下，对蒸馏水透析适当时间后测定溶液盐度。

（3）脱水

浓缩的溶液滴加三倍体积的乙醇搅拌，然后储存在4℃下超过10h。

（4）洗涤和干燥

用乙醇沉淀数次直到上清液透明，甘露聚糖真空过滤，并在60℃下干燥。收集的甘露聚糖是白色无定形粉末。

2 结果与讨论

2.1 预处理

预处理会损失去一部分多糖，所以洗两次是最好的。通过物理或者化学的方法使完整的酵母通过自溶和渗透来提取酵母内容物[14]。葡聚糖和甘露聚糖产量如表2所示。

经过高温高压处理，将混合物离心。这个过程可以有效地分离甘露糖蛋白和葡聚糖。此外，高温高压处理能显著降低细胞壁[16]的机械强度，这可能有助于下酶解。

表2 分别处理葡聚糖和甘露聚糖中固体含量和化学成分

表3 正交实验的设计和结果

2.2 β-D-葡聚糖的分离

2.2.1 碱处理

工艺中氢氧化钠可以去除一些不需要的成分如蛋白质，脂类和多糖。温度，提取时间，料液比、NaOH浓度通常被认为是最重要的因素。优化的β-D-葡聚糖提取合适的提取条件可通过正交实验实现。表3显示了实验条件对碱提取结果的影响。因此，表4列出了K，k、R值。

表4 L9(34)实验结果分析

根据表4中R的数值，以碳水化合物及粗蛋白平均百分比的影响分别是：B＞A＞D＞C，Affgt;Dffgt;Cffgt;B。由于蒸馏水相对便宜，所以增加料液比有助于去除其他杂质，因此，我们选择C2为适用条件。NaOH浓度（因子）的确定的粗蛋白含量和高浓度碱易造成多糖[17-20]降解，因此适用条件是D2。对于葡聚糖提取过程的最优参数组合为A3B2C2D2。即，提取温度，提取时间，料液比、NaOH浓度分别为60℃，3h，1/4，和3%。

2.3 甘露聚糖提取

2.3.1 浓度与透析

上清液（SUP）经过高温高压处理后收集，在旋转蒸发器浓缩。由于SUP含有大量的盐，如果超浓缩过度，盐从溶液中析出，造成多糖的损失，因此，2-3倍是适当的浓度。

经过蒸馏水透析一段时间，盐从溶液中渗透到蒸馏水中。以碳水化合物和灰分的含量为评价指标。溶液盐度和其中碳水化合物和灰分含量的产品之间的关系如图2所示。

图2 透析过程中盐度对碳水化合物和灰分含量的影响

图3 葡聚糖（G）和甘露聚糖（M）的红外图谱

根据分析，随着盐度的降低，碳水化合物和蛋白质都相应增加，灰分减少，即在产品中的活性成分增加。如图所示，灰分随着盐度的变化不断减少。但是，盐度的变化从1.81%到0.06%，9h内灰分下降仅为0.17%，不利于工业化发展。因此，溶液的适宜盐度为0.8%～1.2%。

2.4 产物定性

2.4.1 红外检测

在3384cm-1/3397cm-1，2932cm-1/2922cm-1，1644cm-1/1637cm-1处有明显的吸收带，分别是-OH，C-H键和C=O拉伸吸收峰。在1200cm-1-950cm-1的是C-O振动吸收峰。最重要的约891cm-1处的吸收带说明葡聚糖是β-构型，845cm-1处是α-吡喃环[21]端基异构体形式。在811cm-1和912cm-1处的特殊吸收说明M是α-甘露聚糖[22]，这从他们的单体单元和葡聚糖的特征谱带在1157cm-1，1078cm-1，1040和891cm-1处，这表明链接为β构型。因此，说明产物是β-D-葡聚糖和α-甘露聚糖。如图3所示。

3 结论

新方法在超声处理后采用高温高压法分离β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖通过碱处理和蛋白酶降解法纯化，而甘露聚糖的制备则通过以下步骤包括浓缩、透析、沉降制备。此外，还验证了浓缩液盐度和多糖、灰分和沉降速率的关系，最终确定了整个工艺的最优盐度。

［1］Sanju A N R,Stock R,de Mora J F,et al.Identification of glucanmannoprotein complexes in the cell wall of Candida albicans using a monoclonal antibody that reacts with a(1,6)-β-glucan epitope[J].Microbiology,1995,141(7):1545-1551.

［2］Lipke P N,Ovalle R.Cell wall architecture in yeast:new structure and new challenges[J].Journal of bacteriology,1998,180(15):3735-3740.

［3］Yi H,Xiong S,Du M,et al.Purification and partial characterization ofβglucanase produced by Trichoderma viride TP09 isolated from sewage of beermaking[J].European Food Research and Technology,2008,227(3):821-826.

［4］Hofer M,Posp I V SIl M.Modulation of Animal and Human Hematopoiesis by β-Glucans:A Review[J].Molecules,2011,16(9):7969-7979.

［5］Hofer M,Pospisil M.Glucan as stimulator of hematopoiesis in normal and gamma-irradiated mice.A survey of the authors'results[J].International journal of immunopharmacology,1997,19(9-10):607-609.

［6］Brown G D,Gordon S.Fungalβ-glucans and mammalian immunity[J].Immunity,2003,19(3):311-315.

［7］Ross J S,Schenkein D P,Pietrusko R,et al.Targeted therapies for cancer 2004[J].American journal of clinical pathology,2004,122(4):598-609.

［8］Kim K S,Chang JE,Yun H S.Estimation of solubleβ-glucan content of yeast cell wall by the sensitivity to Glucanex?200G treatment[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,35(6-7):672-677.

［9］Salvador C,Li B,Hansen R,et al.Yeast-Derivedβ-Glucan Augments the Therapeutic Efficacy Mediated by Anti--Vascular Endothelial Growth Factor Monoclonal Antibody in Human Carcinoma Xenograft Models[J].Clinical cancer research,2008,14(4):1239-1247.

［10］Bohn J A,BeMiller J N. (1→3)-β-D-Glucans as biological response modifiers:a review of structure-functional activity relationships[J].Carbohydrate polymers,1995,28(1):3-14.

［11］Domer J E.Candida cell wall mannan:a polysaccharide with diverse immunologic properties[J].Critical reviews in microbiology,1989,17(1):33-51.

［12］Barturen B,Bikandi J,San Mill A N R,et al.Variability in expression of antigens responsible for serotype specificity in Candida albicans[J].Microbiology,1995,141(7):1535-1543.

［13］Dubois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical chemistry,1956,28(3):350-356.

［14］Suphantharika M,Khunrae P,Thanardkit P,et al.Preparation of spent brewer’s yeastβ-glucans with a potential application as an immunostimulant for black tiger shrimp,Penaeus monodon[J].Bioresource Technology,2003,88(1):55-60.

［15］Wang Y,Yao S,Wu T.Combination of induced autolysis and sodium hypochlorite oxidation for the production of Saccharomyces (1-3)-D-glucan[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2003,19(9):947.

［16］Liu X,Wang Q,Cui SW,et al.A new isolation method ofβ-d-glucans from spent yeast Saccharomyces cerevisiae[J].Food Hydrocolloids,2008,22(2):239-247.

［17］Knill C J,Kennedy J F.Degradation of cellulose under alkaline conditions[J].Carbohydrate polymers,2003,51(3):281-300.

［18］Whistler R L,BeMiller J N.Alkaline degradation of polysaccharides[J].Advances in carbohydrate chemistry,1958,13:289-329.

［19］Golova O P,Nosova N I.Degradation of cellulose by alkaline oxidation[J].Russian Chemical Reviews,1973,42:327.

［20］Aspinall G O,Krishnamurthy T N,Furda I,et al.Base-catalyzed Degradations of Carbohydrates.VII.Alkaline Degradation of 3,6-Di-O-substituted Hexoses[J].Canadian Journal of Chemistry,1975,53(14):2171-2177.

［21］Ganner A,Nitsch S,Erlacher K,et al.Ex vivo effect of yeast beta-glucan on lymphocyte viability and plasma IL-18 in weaning piglets[J].Livestock Science,2010,133(1-3):246-248.

［22］Kri V Z Kov A L,V Z It V N Anov A I,Mislovi V C Ov A D,et al.Antioxidant and antimutagenic activity of mannan neoglycoconjugates:Mannan--human serum albumine and mannan--penicillin G acylase[J].Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis,2006,606(1):72-79.