条斑紫菜自由丝状体在不同光照度下的光能利用特征

陶菊红 侯彬彬 周伟 沈宗根 陆勤勤 朱建一 张涛

摘要：通过对光合色素及叶绿素荧光测定，研究了条斑紫菜“苏通2号”自由丝状体在不同光照度下光合生理特征。结果表明，随着光照度的上升，样品藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量均呈下降趋势，且高光照度处理组要显著低于低光照度处理组，叶绿素a的变化与藻胆蛋白相似。藻红蛋白/叶绿素a（PE/Chl a）和藻蓝蛋白/叶绿素a（PC/Chl a）比值随处理光照度上升而下降，但别藻蓝蛋白/叶绿素a（APC/Chla）未有明显变化。高光照度处理组样品最大量子效率（Fv/Fm）显著低于低光照度处理组，且较低光照度处理组样品实际量子效率（ΔF/Fm′）日变化高于高光照度处理组。快速光曲线参数中，初始斜率（α）、最大相对电子传递速率（rETRmax）均随光照度上升而下降，而半饱和光照度（Ik）差异不明显。光化学猝灭（qP）参数随光照度上升而降低，而非光化学猝灭（NPQ）结果与之相反。本研究提示，条斑紫菜“苏通2号”丝状体在较低的光照度下表现出活跃的生理状态，并能通过调节吸收光能分配以适应较高的光照度，这为该品种自由丝状体高效培养的环境设定提供基础参考。

关键词：条斑紫菜;自由丝状体;光照度;光能利用

中图分类号：S968.43+1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）12-0145-05

收稿日期：2021-09-10

基金项目：江苏现代农业（紫菜）产业技术体系建设项目（编号：JATS[2020]464）。

作者简介：陶菊红（1981—），女，江苏苏州人，博士，农艺师，主要从事植物学研究。E-mail：taojuhong@126.com。

通信作者：张 涛，博士，副研究员，主要从事植物学研究。E-mail：zhangtofy@163.com。

紫菜（Pyropia）是一类原始大型红藻，其经济种类条斑紫菜是我国长江以北黄海沿海区域的重要栽培海藻[1]。紫菜具有明显的2个生长世代，叶状体（配子体）为宏观世代，丝状体（孢子体）属微观世代，2个生活世代外观形态完全不同[2-3]，而且生长环境也有明显差别。叶状体世代主要生长期是10月至次年4月，丝状体世代主要生长期是4月至10月，生产上丝状体世代的培养被认为是种苗培育阶段[4-5]。

条斑紫菜产业的发展与其独特的生物学特征密切相关，这表现在育种及种苗丝状体培育等多个方面。条斑紫菜育种由早期通过产量、形态选育的传统育种途径逐步发展到多种育种技术组合应用[6-7]，作为一种原始红藻，其诱变后能够获得较适合的突变率，结合无性生殖和无配生殖等生物学特点，我国近年培育出适用于黄海海区的条斑紫菜新品种“苏通”系列。在新品种的应用方面，需要有配套的生产技术以充分发挥其优良性状，其中，种苗培育技术尤为关键。随着全球气候变化及生产需求，良种種苗由传统的果孢子采苗转变为果孢子结合自由丝状体组合方式，这一变化突出了自由丝状体培养的重要性，因此，如何培养获得足够生物量的良种自由丝状体成为种苗培育的关键。

丝状体作为紫菜的微观世代，其培养过程多是在室内进行，其中，光照度、温度等是影响丝状体生长的重要环境因子，以往的研究也表明，环境条件的改变能够影响丝状体的形态及生物量[8-11]。光合作用与紫菜生物活性有密切关系，光合生理能够及时反映出紫菜生长状态，在光合生理研究中，叶绿素荧光技术因快速、准确、无损伤等特点，已成为环境因子对光合作用影响机制研究中的必备技术[12-13]。有研究表明，紫菜偏向较低光强的适应性[14]，但针对不同生产种质的光适应能力研究尚有不足。本研究以条斑紫菜“苏通2号”品种为材料，通过光合色素、叶绿素荧光参数的测定，分析光照度对其丝状体光合生理的影响，旨在深入了解该品种的光适应机制，并为开发出配套高效丝状体培养技术提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料及光照度处理

条斑紫菜“苏通2号”为常熟理工学院和江苏省海洋水产研究所共同育成的国家紫菜新品种，试验用自由丝状体取自国家级紫菜种质库，光照试验于2021年4月在常熟理工学院苏州应用藻类学重点实验室进行。

选择生长状态良好的自由丝状体，使用破壁机进行处理，将藻体打碎至约100 μm长度，过滤后加入新鲜高温灭菌海水，放置在20 ℃、20 μmol/（m2·s）左右光照度下培养48 h后用于光照处理，期间更换1次灭菌海水。

1.2 试验条件

设定4个光照度，35、70、110、150 μmol/（m2·s），光—暗周期12 h—12 h，温度20 ℃，每个光照度设3组平行试验，处理周期为7 d，在培养5 d时进行叶绿素荧光参数测定，7 d时进行光合色素含量测定。

1.3 叶绿素荧光测定

1.3.1 最大量子效率（Fv/Fm）测定 光照处理 5 d，将样品经黑暗处理使得PSⅡ处于完全开放状态，置于叶绿素荧光仪（Water-PAM，德国）样品槽中进行测定。首先提供测量光[约 0.3μmol/（m2·s）]测定样品最小荧光值（Fo），之后照射0.8 s约4 000 μmol/（m2·s）饱和脉冲光测定样品最大荧光值（Fm），Fv/Fm由公式计算：Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm。

1.3.2 实际量子效率（ΔF/Fm′）的测定 在光照处理5 d进行ΔF/Fm′测定，自光照后0.5 h开始每隔  h 进行1次测定，活化光设定为64 μmol/（m2·s），具体操作流程参考文献[14]。

1.3.3 快速光曲线测定 样品在光照处理6 h后，进行快速光曲线的测定。由Water-PAM依次提供30、45、68、100、150、222、33、503 μmol/（m2·s）活化光，待所提供光强下荧光值（Ft）达稳定后（约 15 s），提供0.8 s饱和脉冲光以测定该活化光下的最大荧光值（Fm′），相对电子传递速率（rETR）按照以下公式计算：

rETR=（Fm′-Ft）/Fm′×PAR×A×0.5;

其中：PAR表示光照度;A表示样品的吸光系数，设定为0.85;0.5表示光能在2个光系统中平均分配。以光照度为x轴、rETR为y轴，可制作出快速光曲线。采用Eilers等的方法[15]对样品快速光曲线进行拟合并计算出快速光曲线的初始效率（α）、最大电子传递速率（ETRm）和半饱和光强（Ik）等参数。

1.3.4 诱导曲线测定

不同光照度处理5 d进行诱导曲线的测定，样品经暗处理0.5 h以上以确保PSⅡ处于完全开放状态，随后由Water-PAM荧光仪提供测量光测得最小荧光值Fo，然后提供0.8 s的饱和脉冲光测定最大荧光值Fm，随后关闭光源，40 s后打开64 μmol/（m2·s）活化光，每隔20 s提供饱和脉冲光直至该活化光下的最大荧光值Fm′达到稳定，按照公示计算相关荧光参数：

qP=（Fm′-Ft）/（Fm′-Fo）;

NPQ=（Fm-Fm′）/Fm′。

1.4 光合色素含量的测定

光照处理5 d后，进行藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白及叶绿素a含量的测定。将自由丝状体过滤并吸干藻体表面水分，电子天平称质量后，加入pH值为6.8的磷酸缓冲液进行研磨，充分研磨至糊状后，转移至离心管中，缓冲液润洗研钵，汇入至离心管中，4 ℃，避光静置30 min以充分提取藻胆蛋白，随后4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，上清液为藻胆蛋白提取液，采用磷酸缓冲液定容后，参照Bennet等的方法[16]进行藻胆蛋白含量的测定和计算。在上述离心后的沉淀中加入80%（体积分数）丙酮，4 ℃黑暗条件下放置24 h以提取样品中叶绿素a，4 ℃、8 000 r/min 离心10 min，取上清液，定容后按照文献[17]方法进行叶绿素a含量的测定和计算。

1.5 统计分析

数据采用t-检验分析，显著水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 光照度对条斑紫菜自由丝状体藻胆蛋白含量的影响

不同光照度处理会影响条斑紫菜“苏通2号”藻胆蛋白含量。由图1可知，随着光照度上升，样品中藻红蛋白含量逐渐下降，35 μmol/（m2·s）光照度处理组显著高于110 μmol/（m2·s）和 150 μmol/（m2·s） 光照度组（P<0.05），下降约40%;藻蓝蛋白含量变化更为明显，由35 μmol/（m2·s）光照度组的1.60显著下降至150 μmol/（m2·s）光照度组的0.72（P<0.05），下降约55%;别藻蓝蛋白含量也随光照度上升而显著下降，110 μmol/（m2·s）、150 μmol/（m2·s）光照度组均显著低于 35 μmol/（m2·s） 光照度组（P<0.05）。

2.2 光照度对条斑紫菜自由丝状体叶绿素a含量的影响

由图2可知，随着处理光照度上升，样品叶绿素a含量逐步下降，其中，110 μmol/（m2·s） 和 150 μmol/（m2·s） 光照度组样品较 35 μmol/（m2·s） 光照度组显著下降约17%（P<0.05）。

2.3 光照度对条斑紫菜自由丝状体光合色素比值的影响

由表1可知，光照度上升使样品藻红蛋白/叶绿素a（PE/Chl a）、藻蓝蛋白/叶绿素a（PC/Chl a）下降，其中，PE/Chl a由35 μmol/（m2·s）光照度组的2.98显著下降至 150 μmol/（m2·s） 光照度组的2.17（P<0.05）。35 μmol/（m2·s） 和70 μmol/（m2·s）光照度组样品PC/Chl a差异不显著（P>0.05），但二者均显著高于 110 μmol/（m2·s） 和150 μmol/（m2·s）光照度组（P<0.05）;不同光照度下样品别藻蓝蛋白/叶绿素a（APC/Chl a）未表现出显著差异（P>0.05）。

2.4 光照度对条斑紫菜自由丝状体最大量子效率的影响

由图3可知，随着处理光照度上升，Fv/Fm逐步下降，35 μmol/（m2·s）光照度组显著高于其他光照度组（P<0.05），70 μmol/（m2·s）光照度组显著高于150 μmol/（m2·s）光照度组（P<0.05），而 110 μmol/（m2·s） 和150 μmol/（m2·s）光照度组差异不显著（P>0.05）。

2.5 光照度对条斑紫菜自由丝状体实际量子效率日变化的影响

由图4可知，35、70 μmol/（m2·s）光照度处理组样品在照光后ΔF/Fm′变化不明显，基本维持在0.43左右，而 150 μmol/（m2·s） 光照度处理组ΔF/Fm′在照光约 .5 h 表现出显著下降，随后维持在0.34左右;比较不同光照度處理组可知，35、70 μmol/（m2·s） 光照度组样品在不同照光时间的ΔF/Fm′均显著高于对应的110、150 μmol/（m2·s）光照度组（P<0.05）。

2.6 光照度对条斑紫菜自由丝状体快速光曲线的影响

由图5可知，不同光照度处理组样品相对电子传递速率（rETR）随着活化光光照度的上升而快速上升，当光照度达约400 μmol/（m2·s）时，rETR达最大值。不同光照度处理组在光曲线初始斜率、最大相对电子传递速率存在差异，35 μmol/（m2·s）光照度处理组初始斜率要高于其他光照度处理组，而且当光照度超过100μmol/（m2·s）时，rETR值随处理光照度上升而下降，如在503 μmol/（m2·s）活化光处，35 μmol/（m2·s）处理组rETR约34.54，而 150 μmol/（m2·s） 处理组rETR为26.17，降低幅度达24%。

对快速光曲线的拟合可得到快速光曲线初始斜率（α）、最大相对电子传递速率（rETRmax）和半饱和光照度（Ik）等参数，由表2可知，处理光照度的上升会引起α下降，35、70 μmol/（m2·s）光照度组要显著高于110 、150 μmol/（m2·s）光照度组;rETRmax也随处理光照度的上升而下降，其中，35 μmol/（m2·s）光照度组要显著高于110、150 μmol/（m2·s）光照度组;不同光照度处理组样品Ik值略有差异，但未达显著性差异（P>0.05）。

2.7 光照度对条斑紫菜自由丝状体光诱导曲线的影响

不同光照度下丝状体样品光诱导曲线参数的测定结果，由表3可知，110 μmol/（m2·s）光照度处理组光化学猝灭系数（qP）最低，而其他处理组间无显著性差异（P>0.05）;非光化学猝灭系数（NPQ）的变化与qP不同，35 μmol/（m2·s）光照度组要显著低于110、150 μmol/（m2·s）光照度组（P<0.05）。

3 讨论

我国是经济海藻生产大国，其中，条斑紫菜经过数十年的发展已形成育种、栽培、加工、销售完整的产业链。紫菜产业发展中，良种选育及配套的种苗培养技术是关键环节，我国近年育成“苏通”系列新品种，在新品种的推广过程中，种苗培育被认为是重点。将丝状体培养成悬浮在液体介质中的自由生活状态[18]，可保存和大量培育良种种质，目前，自由丝状体被认为是紫菜生产的重要保障[19]，除可用来保存种质资源外，已成为接种贝壳丝状体的主要来源，因此自由丝状体的人工培养得到越来越多的重视。自由丝状体人工培养过程中，光照度是关键的环境因子，基于形态、生物量、生长速率等的研究表明，较低的光照度对丝状体的生长是适宜的[8-9，11]，本研究结果显示，条斑紫菜丝状体在35、70 μmol/（m2·s）光照度下具有较高的光能利用效率，Zhang等的研究也表明紫菜丝状体具有低光照度下进行光合作用的能力[20]，此外低光照度下紫菜丝状体光合色素含量也处于较高水平，随着光照度上升，丝状体对光能的利用效率降低，说明条斑紫菜“苏通2号”品种符合该物种适应于较低光照度的生物学特征。

条斑紫菜光合特性能够反映出不同光照度等环境条件下的生理状态，通过光合生理的测定表明，高温高光照度的逆境条件下，条斑紫菜营养藻丝光合作用被严重抑制[21]，即使在合适温度下，过高的光照度也会引起紫菜对光能利用效率降低[22]。叶绿素荧光参数中，Fv/Fm对外界胁迫敏感，当该值发生明显下降时表明PSⅡ反应中心受到不同程度的功能损伤，本研究中不同光照度处理一定时间后，强光组紫菜丝状体Fv/Fm下降显著，说明此时样品PSⅡ已受到明显功能损伤，实际量子效率、快速光曲线α值也表明样品对光能的利用效率降低，rETRmax参数的降低表明样品PSⅡ电子传递能力因光照度过高而降低，qP值变化不明显可能与测定活化光照度度较低有关，但NPQ在高光照度环境下升高说明存在光保护机制，Ik值的变化也支持了这一结果[23]，紫菜丝状体通过将吸收过多光能以热的形式耗散，降低对光能的利用效率，但保护PSⅡ免受不可逆伤害。高光照度引起紫菜丝状体光能利用能力的降低与光合色素的变化也密切相关，作为捕光色素的藻胆蛋白，其含量随光照度的上升而逐步下降，而且藻红蛋白、藻蓝蛋白对光照度更加敏感，而别藻蓝蛋白、叶绿素a相对稳定，因此认为PE和PC含量显著下降是紫菜丝状体对光能的吸收利用效率降低的主要原因。

本研究通过光合色素、叶绿素荧光参数的测定，分析了不同光照度下条斑紫菜“苏通2号”自由丝状体对光能利用的特征，可为该品种高效的人工培养提供理论支撑。

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