基于分子对接从天然产物中虚拟筛选HPPD先导化合物

刘学贵 周静瑶 黄明远 岳丹丹 吕梦超 孙羽俅 高品一 李丹琦

摘要：对羟基苯丙酮酸双加氧酶（p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，简称HPPD）作为一种化学除草剂的重要靶标酶已引起越来越多的关注。基于分子对接技术，以HPPD靶蛋白为受体，通过研究配体与受体的结合模式，以商品化除草剂吡草酮为阳性对照，对课题组从天然植物透骨草和紫花苜蓿中分离得到的41个化合物进行虚拟筛选，根据对接得分以及分析结合模式得出10个对靶标活性位点具有较好潜在抑制活性的化合物，同时，分数高于吡草酮的化合物4′-氧-（赤型-β-愈创木脂甘油基）醚、4′-氧-（苏型-β-愈创木脂甘油基）醚和（3R）-7-羟基-2′，4′，5′-三甲氧基-异黄烷-7-氧-β-D-葡萄糖苷不仅可以完全嵌入HPPD活性囊中，且存在与吡草酮相似的氨基酸残基作用以及氢键和π-π堆积等作用。上述结果对设计新型高效的HPPD抑制除草剂具有重要的指导意义，也为使用计算技术开发新型HPPD抑制剂除草剂提供了重要参考。

关键词：对羟基苯基丙酮酸双加氧酶;除草剂;分子对接;天然产物;先导化合物;筛选;吡草酮

中图分类号： S482.4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）24-0095-07

众所周知，杂草在农作物的整个生长过程中参与争夺水分、养分、光照和空间，因而被公认为是对农作物生产的普遍威胁[1-4]。除草剂是现代农业中控制杂草的重要工具[5-6]。对羟基苯丙酮酸双氧化酶（p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，简称HPPD）是除草剂中最重要的靶标酶之一[7]。它是一种与大多数生物体中的色素合成和酪氨酸分解代谢有关的重要酶，在农业和治疗领域的药物发现中都非常重要[8-12]。在自然界中，HPPD催化4-羟基苯丙酮酸（p-hydroxyphenylpyruvate，简称HPPA）转化为尿黑酸（4-hydroxyphenylpyruvate，HGA），抑制HPPD会阻止光合作用，从而导致质体醌和生育酚不足，并最终导致植物生长抑制、坏死和死亡[13-16]。自20世纪90年代以来，HPPD作为除草剂研究与开发的一个重要靶标酶始终是农药化学研究领域的热点。以HPPD为靶标的除草剂已上市多年，其中包括三酮类、吡唑类和异唑类等[17-18]。然而，杂草对商品化除草剂的抗药性不断增强[19-20]，以及它们对环境和人类的毒副作用，导致人们迫切地想从天然产物中寻找新型除草剂，从而减缓抗性的发展并减少环境污染[21-22]。目前，已有报道证明HPPD抑制剂的先导化合物可来自桃金娘科（Myrtaceous）植物的挥发油纤精酮（leptospermone）[23]。因此，基于天然产物的除草剂研究越来越受到农业领域的关注[24-26]。

天然产物具有多种生物学特性，常被用于解决农业生产中的病虫害问题，特别是植物源天然活性物质，可为农药的活性结构提供多种主要的先导构型[27]。笔者所在课题组前期致力研究的透骨草和紫花苜蓿均为分布广泛、药用历史悠久的多年生草本植物，其化学成分具有广泛的生物活性，具备良好的植物杀虫剂和绿色除草剂开发潜力[28-29]。另外，在农药研发领域，越来越多的研究通过使用计算化学在农药分子设计与开发方面取得了重大突破。有研究者成功利用基于分子对接的虚拟筛选方法，得到HPPD抑制剂[30-31]。Fu等[32]成功构建了基于药效团模型的虚拟筛选，利用分子对接技术识别HPPD活性位点关键残基之间的相互作用，并识别出了潜在的HPPD抑制剂。分子对接已经被证明是一个越来越重要的工具，其主要目的是通过计算方法预测配体-受体的复杂结构，对庞大的化合物库进行虚拟筛选，根据分数对结果进行排序，并分析配体-受体的作用方式，这在先导化合物的发现和优化中至關重要[33]。

基于上述情况考虑，本研究通过分子对接技术，从天然产物透骨草和紫花苜蓿中筛选出具有潜在HPPD抑制剂效用的化合物成分，以备后期对其进行结构修饰，为进一步设计出新型绿色的HPPD小分子除草剂提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 软件

运用软件SYBYL-X 2.0（试用版）进行分子对接操作，采用软件Discovery Studio ViewerPro （DS ViewerPro） 5.0进行对接模式分析。

1.2 受体蛋白的收集与处理

从RCSB蛋白数据库中获取含有原配体的HPPD靶蛋白复合物晶体结构（PDB ID：1T47），并以pdb文件格式下载保存。该晶体结构（图1）分辨率为2.50 ，符合对接的精确要求。利用Sybyl-X 2.0软件对目标蛋白进行修饰，提取配体保存为1T47_ligand.mol2文件，去除靶蛋白中的水分子以及金属离子，对晶体结构中缺失的氨基酸残基进行修正，并加氢，然后再对蛋白质晶体结构进行优化，最后生成活性口袋，保存文件1T47_H-L-0.50-0.sfxc用于后续的Surflex-Dock对接。

1.3 配体库的构建

自天然植物透骨草和紫花苜蓿中分离提取出的化合物主要来源于课题组前期的研究[34-37]。将41个化合物的平面结构保存为MDL Molfile （*.mol）格式，随后将化合物的3D结构以mol.2格式保存，建立化合物库。

1.4 分子对接

利用Sybyl-X2.0软件中的Surflex-Dock程序，分别导入准备好的蛋白sfxc格式文件和小分子化合物，选择之前提取出的1T47_ligand.mol2作为参考配体，其他对接参数设为系统默认值即可开始对接。对接完成后整理结果，借助DS ViewerPro 5.0软件将化合物与靶蛋白的结合效果进行可视化并构成模式图。

2 结果与分析

2.1 对接结果

在软件的结果界面，可以看到每個配体-受体的对接得分，整理排序见表1。对接打分函数 total-score 综合考虑了分子极性、疏水性和焓值等因素，是评价小分子和蛋白结合能力强弱的标准，打分越高表示受体与配体的亲和能力越好。一般认为，total-score大于或等于7分有较好活性，大于或等于9分有非常好的活性[38-39]。通过对接，筛选出结合效果较优（即total score≥7）的化合物分子10个（图2）。其中，化合物A、B、D、F、G、I是从透骨草中分离提取得到的，化合物C、E、H、J是从紫花苜蓿中分离提取得到的。值得注意的是，化合物A、B、C的对接得分高于商品化除草剂吡草酮（benzofenap，得分8.78），有望成为潜在的HPPD抑制剂先导化合物。

2.2 可视化分析

现以对接得分较高的这些候选分子为例，说明这些化合物的对接模式，配体化合物结构见图2。以蛋白1T47原配体和除草剂吡草酮的对接模式图（图3、图4）为对照，分析这10个化合物分别与靶蛋白1T47的结合模式（图5、图6），通过比较说明它们之间相似的相互作用模式。

由图3可看出，蛋白1T47中的配体与周围的氨基酸残基Phe364、Phe336和Leu367有疏水相互作用，与Phe364和Phe336形成π-π堆积作用，与His270有氢键作用，Asn363连接在卤素原子位置。由图4可知，在吡草酮的对接构象中，配体完全嵌入活性口袋中，化合物与Phe359、Phe336和His270形成了π-π堆叠式相互作用，Phe364处有氢键作用，吡草酮的苯环面对面地与Phe336相互作用，Val217、Pro243、Val232、Phe347、Phe367在烷基上发挥作用，且它们之间都存在疏水相互作用。

由图5可以直观地了解到各个分子与靶蛋白1T47相对接的作用模式。化合物A与该蛋白的Glu349、Asn245、Thr295、Lys252有氢键作用，其中Asn245作用于羰基，Glu349和Thr295作用于羟基。该化合物与Gln255生成碳氢键，与Val189、His270、Phe336、Phe364、Leu367、Leu293存在疏水相互作用。配体B与1T47的Ser230、Phe359、Thr295有常规氢键作用，与Gln255和Gly360产生碳氢键，与Phe364和Phe336有π-π堆叠式作用，与Pro243、Leu293、Leu228、His270以及Leu367存在疏水相互作用。配体C与1T47的Asn245和Phe359有常规氢键作用，与His270产生碳氢键，与Phe364、Phe336、Leu293和Leu367存在疏水相互作用。

由图6可看出， 化合物D中， Glu349生成了范德华力，His270、Phe359和Gly360有常规氢键作用，Thr295、Glu215处有碳氢键生成，Ser230存在供氢作用，Leu293对烷基作用，Phe336在苯环处形成 π-π 叠加作用。化合物E中Gln255与Gln269在环上3个羟基处有常规氢键作用，Phe364作用于苯环产生堆叠效果，Ser230、Phe359、GLY360和Gln334处分别有碳氢键生成，Val232与Val217作用于烷基，存在疏水相互作用。化合物F中His187和Glu349产生范德华力，Asn245在羰基和羟基处、Gln255在氧原子处以及His 270在羟基处均有常规氢键作用，Phe364和Phe336在苯环上形成T形作用，Val189垂直于苯环内产生烷基作用。化合物G中Ser230在羰基处和Thr295在羟基处有常规氢键作用，Phe364在苯环上有π-π叠加作用，Val217、Val232、Phe359三者均连在末端烷基位置上，Leu367和Leu293呈对立面作用在苯环上。化合物H中Lys252和Asn245连在氧原子上产生氢键作用，TYR225和Phe364位于架构前端有碳氢键，Phe336在苯环上有π-π叠加作用，Leu367有烷基作用。化合物I中在羰基处的残基Asn245和羟基处的Gln334存在常规氢键作用，Ser230连接在碳氢键上，Phe364和Phe359在苯环上产生π-π堆叠式作用，Val232、Val189和Pro243作用于烷基，也存在疏水作用。化合物J中Gln269、Ser230连在氧原子上，以及羟基处的Gln255都产生常规氢键作用，Phe364在苯环上形成T形作用。

3 讨论与结论

吡草酮是一种典型的吡唑类商品化除草剂，2-苯甲酰基乙烯-1-醇基团作为一个共同的结构单元，存在于其化合物分子或其异构体或其代谢物中，充当底物HPPA的α-酮酸部分的等排体，并且，2-苯甲酰基乙烯-1-醇基团具有与HPPA竞争HPPD活性中心的能力。由此可见植物进入白化状态是归因于其吡唑部分与HPPD的结合和它的酶抑制性[40]。吡唑类结构主要包括吡唑部分和苯环部分，近年来不断有研究对其结构进行优化，特别是苯并杂环类，发现了许多优秀的广谱除草剂先导化合物[10，41-43]。

通过分子对接模拟，我们发现抑制剂小分子的烯醇结构是与氨基酸残基配位的关键，另外一个重要的作用力就是小分子与氨基酸残基形成的 π-π堆积作用[44]。通过比较发现，在蛋白1T47原配体和吡草酮的对接结果中，Phe359、Phe336、His270、Phe364等氨基酸残基在活性位点发挥了重要的作用，同时，本课题组经虚拟筛选得到的分数高于吡

草酮的化合物（A、B、C）不仅可以完全嵌入HPPD活性囊中，而且周围都存在关键的氨基酸残基参与作用，与蛋白1T47原配体和吡草酮中产生的氢键和 π-π 堆积等作用相似。这些共同点证明了这3个化合物有潜力成为HPPD抑制剂的先导化合物，可用作进一步优化设计新的HPPD潜在抑制剂的依据。本研究提供了一套基于分子对接筛选HPPD抑制剂先导化合物的方案，为后期设计、合成新型绿色高效的HPPD抑制剂除草剂提供了参考。

致謝：由衷地感谢Tripos公司提供的软件SYBYL-X 2.0（试用版），为本研究中进行分子对接创造了技术条件。

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