江苏省栝楼烂果病病原鉴定及室内防治药剂筛选

孙凯 陈夕军 沈迎春 徐冬祥 陈宸 黄奔立

摘要：为明确江苏省栝楼果实腐烂病病原并选择对其有效的防控药剂，从田间采集病果，经单孢分离后，运用形态学和分子生物学方法进行鉴定。根据菌丝形状、菌落特征、孢子形态与类型，并结合病菌ITS区序列分析，明确引起江苏省栝楼果实腐烂病的病原菌为拟茎点霉。室内毒力测定结果表明，吡唑醚菌酯、咪鲜胺、多菌灵、戊唑醇、嘧菌酯、丙硫菌唑和中生菌素等药剂对该病菌均有较高的毒力，抑制中浓度（EC50）为0.005 5～19.947 3 mg/L;而噻呋酰胺、多抗霉素和春雷霉素对该病菌基本无抑制作用，即使浓度大于200 mg/L，菌丝生长抑制率也仅为20%～30%。明确病原物及化学药剂对该病菌的毒力，将为该病的发生、流行和防控研究提供理论依据。

关键词：病原鉴定;毒力测定;杀菌剂;烂果病;栝楼

中图分类号： S435.67  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）24-0112-05

栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim），葫芦科栝楼属多年生藤本植物，又称瓜蒌、药瓜、野瓜、吊瓜、野葫芦等，是一种重要的中药材。《神农本草经》中将之归为药之中品，注“味苦寒、主消渴、身热、烦满大热、补虚安中、续绝伤”;《本草纲目》中认为栝楼有治痰热咳嗽、胸痹、结胸、肺痿咳血、消渴、黄疸、便秘和痈肿初起的功能[1]。2019年末至今，新型冠状病毒肺炎肆虐全国，并在世界多个国家和地区蔓延。马婧等基于冠状病毒的木瓜样蛋白酶（papain-like proteases，PLP）进行中药成分-靶点分子对接筛选发现，栝楼中有5种活性成分可与PLP形成复合物，其中主要活性成分为栝楼酯碱，说明栝楼可作为防治新冠肺炎的汤剂成分[2]。而且，以栝楼为主要成分的多种中药汤剂对其他急慢性肺病均有较好的临床效果[3-5]。

正因為瓜篓药用价值高，栝楼籽又可作为休闲食品，近年来全国栝楼种植面积不断增加。在江苏省各地，多个以栝楼种植为特色的“栝楼小镇” “栝楼康养小镇”和“栝楼产业示范园”相继出现，其中种植面积过万亩的盐城市阜宁县郭墅镇、宿迁市宿豫区大兴镇、宿迁市沐阳县沂涛镇和淮安市淮阴区西宋集镇等更是将栝楼作为地方重点扶持的产业（产业调研数据）。但随着栝楼种植年限的延长，栝楼病害也越来越严重，其中栝楼炭疽病、根结线虫病、蔓枯病等已成为制约江苏省栝楼产业发展的重要因子[6-8]。尽管有研究者提出多种针对栝楼重要病害的防控措施[9]，但实际效果不佳，如2018年盐城市阜宁县郭墅镇出现千亩栝楼果实未熟便腐烂的现象，导致严重的减量和经济损失，当地技术部门以防控炭疽病的方法进行病害治理，防效很差，且该病在田间与炭疽病症状存在一定差异。本研究通过单孢分离获得病原物，经形态与分子生物学鉴定明确引起该病的病原物，并通过室内毒力测定筛选有效药剂，旨在为该病的田间防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

栝楼病样：2018年11月采自江苏省盐城市阜宁县郭墅镇栝楼病田。

供试化学药剂：98%吡唑醚菌酯（江苏剑牌农化股份有限公司）、95%丙硫菌唑（山东海利尔化工有限公司）、98%咪鲜胺（江苏辉丰生物农业股份有限公司）、98%戊唑醇（江苏龙灯化学有限公司）、98%嘧菌酯（青岛润农化工有限公司）、98%多菌灵（江苏瑞邦农化股份有限公司）、96%噻呋酰胺（浙江天丰生物科学有限公司）、12%中生菌素（福建凯立生物制品有限公司）。

1.2 病菌的单孢分离

于田间采集的栝楼病样的病健交界处取1～2 mm 组织块，2%次氯酸钠表面消毒后，置于含有0.3%乳酸的PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g，葡萄糖17 g，琼脂粉17 g，水 1 000 mL）平板表面，待组织块周围有菌丝长出时，在无菌操作台中将菌丝移至新的PDA平板。10 d后，用挑针挑取少许菌丝置于200 μL无菌水中，轻微振荡至孢子均匀分散后，用移液器吸取100 μL孢子液均匀展布于水琼脂（琼脂粉20 g，水1 000 mL）平板。用灭菌解剖刀将涂有孢子液的水琼脂平板细划成1～2 mm小块，显微镜下挑取有单个孢子的水琼脂小块置于PDA斜面，待菌丝长出后即得单孢菌株。

1.3 病原菌的形态与生物学鉴定

采用常规方法进行病原菌形态与生物学鉴定。从果实病部取2 mm见方组织块，手工切片后制作水浸片，显微镜下观察分生孢子形态。从活化的菌落边缘用打孔器取直径6 mm的菌丝块置于PDA平板中央，4 d后测量菌落直径。待菌丝快长满平板时，观察菌落形态、有无色素，显微镜下观察菌丝和分生孢子形态，测量孢子大小等。

1.4 ITS区扩增与序列测定

将置于马铃薯葡萄糖培养液（PDB），温度 25 ℃，转速120 r/min振荡培养72 h的菌丝球过滤，用无菌水冲洗后，抽滤去水分，加入液氮研磨成粉末。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取病菌基因组DNA[9]。ITS区扩增使用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTCATATGC-3′）。20 μL反应体系（10×Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1 μL、10 μmol/L ITS1 1 μL、10 μmol/L ITS4 1 μL、5 U/μL Taq酶 0.5 μL、30 ng/μL Template DNA 1 μL、ddH2O 13.5 μL）。反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1.0 min，35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用北京索莱宝科技有限公司生产的DNA回收试剂盒D1200进行片段回收，具体方法参照说明书进行。回收片段连接至pMD19-T克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，具体方法参见文献[10]。阳性转化子送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 系统进化树构建

从NCBI中搜索不同真菌来源的ITS区序列，利用MEGA 5.1软件构建系统发育进化树。

1.6 生产常用药剂对病原菌的毒力测定

按照预试验结果，分别将供试药剂吡唑醚菌酯（0.001、0.002、0.004、0.008、0.016 mg/L）、丙硫菌唑（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L）、咪鲜胺（0.001、0.002、0.004、0.006、0.008 mg/L）、戊唑醇（0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 mg/L）、嘧菌酯（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L）、多菌灵（0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/L）、噻呋酰胺（10、25、50、100、200 mg/L）、中生菌素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0）、多抗霉素（10、25、50、100、200 mg/L）和春雷霉素（10、25、50、100、200 mg/L）配成梯度浓度含药培养基，以不含药的空白PDA培养基为对照。从活化的菌落边缘打孔取直徑6 mm菌丝块置于平板中央，待对照菌落快长满平板时，测量各处理菌落直径，计算半最大效应浓度（EC50）。每处理重复3次，试验重复2次。

2 结果与分析

2.1 病菌形态学鉴定

从田间采集后期病果，于体视显微镜下观察，可见果皮表面存在大量黑色连片黑点（分生孢子器），这些黑点部分埋生于寄主表皮下，部分突破表皮外露。病菌形态学鉴定表明，菌落为白色至灰白色，绒毛状，菌落中央霉层密实、边缘稀疏，PDA培养基上生长4 d后菌落直径可达8.0 cm左右（图1-A）;菌丝为有隔菌丝（图1-B）;组织切片与培养基中均能产生2种类型的分生孢子，甲型（ɑ）分生孢子为无色、单孢、椭圆形至纺锤形，少数一端尖细微弯曲，孢子中含有2个油球，大小为（4.8～7.9 ） μm×（1.5～2.6 ） μm（图1-C）;乙型（β）分生孢子无色、单孢、细长线形、少数顶端成钩状（图1-D）。

2.2 病菌分子生物学鉴定

琼脂糖凝胶电泳显示，使用ITS1/ITS4引物对可从分离的病菌gDNA中扩增出单一条带，大小约600 bp，测序结果表明该片段长574 bp（图2）。经与NCBI中其他真菌ITS区序列进行Blast比对，发现其与拟茎点霉属ITS区序列相似度高达95%以上，覆盖率为86%～100%（图3）。进一步搜索GenBank中所有拟茎点霉属ITS区序列，以MEGA 5.1软件制作系统进化树，发现其与所有拟茎点霉属真菌种均不能归在一起， 虽然与Phomopsis vexans相近，但并不完全在一个分支上，因此要使用更多的基因序列才能确定（图4）。结合形态与分子生物学鉴定结果，笔者认为栝楼烂果病病原菌为拟茎点霉属，但具体是何种还需进一步鉴定。

2.3 生产常用药剂对栝楼腐烂病菌的毒力

毒力测定结果表明，供试的生产上常用杀菌剂对栝楼烂果病病菌大多具有较强的毒力，EC50为0.005 5～19.947 3 mg/L（表1）;但噻呋酰胺、多抗霉素和春雷霉素对栝楼烂果病病菌无明显抑制效果，在 5～100 mg/L浓度含药平板上，菌落直径差异不大，即使平板含药浓度达200 mg/L，其对菌落生长的抑制率仍只有20%～30%（图5）。

3 讨论

栝楼是重要的药用植物，栝楼籽也是营养价值极高的休闲食品，两者市场需求量极大。近年来，全国多地将栝楼种植作为脱贫帮困项目， 仅江苏省栝楼种植面积就超10万亩，但栝楼种植过程中病害的危害也日趋严重。有研究者鉴定了栝楼根结线虫的种类[6]，也对栝楼炭疽病病菌的生理生态及病害防治做了相关研究[11-12]，但总体来说目前对栝楼病害的研究还处于初步阶段，报道的栝楼常见病害也只有枯萎病、蔓枯病、炭疽病、根结线虫病和病毒病[13-16]。2016年，Zhang等首先报道了由链格孢引起的栝楼叶枯病，并对其病菌致病性做了测定[17]。而关于栝楼烂果病目前国内外还未见报道，鉴定其病原，并筛选对其有较高毒力的化学药剂，将为生产上进行该病的防控提供重要的理论依据。

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