乌鳖黑色素提取工艺及其结构性状

陈逍遥 赵琼瑜 彭振辉 宋伟

摘要：以乌鳖肌肉为原料，采用“脱脂—酶解—酸解”三步法提取乌鳖黑色素，研究脱除蛋白、分离纯化乌鳖黑色素的工艺条件，通过扫描电镜对乌鳖黑色素纯化效果进行观察，并用傅里叶红外光谱仪对其结构进行分析。最佳脱脂工艺为：乙醇回流脱脂8次，料液比1 g ∶ 60 mL，脱脂率为98.99%。脱脂后用木瓜蛋白酶进行酶解，其最佳工艺为：酶底比为1 mg ∶ 2 g、酶解温度60 ℃、酶解时间5 h、料液比1 g ∶ 25 mL、酶解pH值5.0，蛋白质脱除率最高;酸纯化的最优工艺为：盐酸浓度6 mol/L、料液比1 g ∶ 15 mL、时间4 h、温度100 ℃，蛋白质脱除率最高。在“脱脂—酶解—酸解”条件下总杂质脱除率高达98.91%。通过扫描电镜可见纯化黑色素为均匀的椭圆形颗粒，颗粒表面光滑清晰，同时结合傅里叶红外光谱具有非常典型的吲哚结构，提取的乌鳖黑色素纯度高、结构完整，可用于降解和结构研究。

关键词：乌鳖;黑色素;提取工藝;脱脂工艺;酶解工艺;酸纯化工艺;结构性状

中图分类号： TS254.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）24-0182-07

清溪乌鳖（Pelodiscus sinensis，简称乌鳖）是从中华鳖的体色变异个体经过扩繁得到的新品种[1]，是浙江省特有地方品种，其典型形态特征是全身体色乌黑，富含黑色素，具有很高的食用价值和药用价值[2]。黑色素是目前所知唯一能保护生物体免受辐射伤害的天然内源性生物聚合体[3]，具有很强的生理活性，能够有效地消除自由基[4-5]，对人体具有提高机体免疫力[6]、防止衰老[7-8]、抑制病毒[9]等功能，因此黑色素被广泛应用于医药、食品和保健品等领域。

目前，天然黑色素的开发研究主要集中在植物和真菌类材料，包括黑米[10]、山杏[11]、黑木耳[12]、灵芝等[13]，主要采用超声波辅助提取法。动物中黑色素与蛋白质紧密相连、不易分离，要获得比较纯净的黑色素，就必须尽可能去除蛋白质等杂质。因此，动物来源的黑色素研究只局限在乌骨鸡等少数动物材料中。但国内外学者主要从形态特征[1]、养殖性能[14]、营养成分[15]、同工酶[16]、细胞水平和DNA 分子水平[17]等方面对乌鳖种质资源进行研究。有关乌鳖中黑色素的研究却鲜见报道。因此，本试验以乌鳖为研究对象，系统建立乌鳖的黑色素提取工艺，探究乌鳖的黑色素结构性状，有利于乌鳖的高附加值综合利用，对加快黑色食品的发展具有十分重要的理论意义和实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成体乌鳖，体质量约为500 g，购于浙江清溪鳖业股份有限公司。

主要仪器有ME204型电子天平，购自梅特勒-托利多公司;DS-1高速组织捣碎机，购自上海标本模型厂;Alphal-4LSCplus冷冻干燥机，购自德国Christ公司;5810大容量低温高速台式离心机，购自德国Eppendorf公司;DHG9246A型电热鼓风干燥箱，购自上海精宏实验设备有限公司;Cary100紫外可见分光光度计，购自安捷伦科技有限公司;S-4800型场发射扫描电镜，购自日本日立公司。

主要试剂有黑色素标准品（M2649），购自Sigma公司;木瓜蛋白酶，购自生工生物工程（上海）股份有限公司;无水乙醚、石油醚、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠等，均为国药分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 乌鳖肌肉主要成分的测定 乌鳖肌肉中水分含量测定参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中105 ℃干燥恒重法;粗蛋白含量测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》自动凯氏定氮仪法;粗脂肪含量测定参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》索氏抽提法;灰分含量测定参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中550 ℃马弗炉干法灰化法。

1.2.2 乌鳖肌肉预处理 在实验室活体宰杀后剥离肌肉，在高速组织匀浆机中打碎成肉糜，于冷冻干燥机中冻干，-20 ℃密封保存备用。

1.2.3 脱脂工艺的优化 （1）单因素试验。精确称取样品置于索氏提取器中，在不同溶剂（无水乙醚、石油醚、无水乙醇）、回流次数（4、5、6、7、8、9）、料液比（1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 60 mL、1 g ∶ 75 mL、1 g ∶ 100 mL、1 g ∶ 150 mL）等因素下测定脱脂效果。脱脂反应结束后，滤液真空浓缩，得乌鳖油脂，滤渣置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒质量，称质量，计算脱脂率，评价各条件对乌鳖肌肉脱脂效果的影响。

乌鳖油脂脱除率=乌鳖油脂质量（g）乌鳖粗脂肪含量（g）×100%。

（2）正交试验设计。通过单因素试验的优化，以无水乙醇为脱脂浸提试剂，选择料液比（A）、回流次数（B）作为试验因子，采用Design-Expert软件设计L9（32）正交试验条件，以脱脂率作为评价指标，筛选最佳脱脂工艺。

1.2.4  酶解制备黑色素的工艺优化 （1）单因素试验。精确称取一定量的脱脂样品，将其置于蛋白酶反应液中，在不同蛋白酶[木瓜蛋白酶（55 ℃，pH值5.5）、胃蛋白酶（37 ℃，pH值2.5）、胰蛋白酶（37 ℃，pH值8.0）]、料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL）、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、温度（50、55、60、65、70、75 ℃）、酶底比[1 mg ∶ 4 g、1.5 mg ∶ 4 g、2 mg ∶ 4 g、3 mg ∶ 4 g、4 mg ∶ 4 g（质量比，下同）]、酶解时间（3、4、5、6、7 h）单因素下测定蛋白脱除效果。将样品置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒质量，称质量，计算蛋白质脱除率，评价各条件对乌鳖肌肉脱蛋白效果的影响。

蛋白质脱除率=乌鳖干肉（g）-酶解残渣质量（g）乌鳖干肉质量（g）×100%。

（2）正交试验设计。以单因素试验筛选的酶解温度（C）、酶解时间（D）、料液比（E）和酶解pH值（F）作为试验因子，采用L9（34）正交试验条件，以蛋白质脱除率为评价指标，筛选最佳工艺。

1.2.5 酸法纯化黑色素的工艺优化 （1）单因素试验。精确称取一定量的黑色素粗品，将其置于盐酸反应液中，在不同时间（1、6、12、24、48 h）、温度（25、60、70、80、90、100 ℃）、盐酸浓度（1、3、6、9、12 mol/L）、料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 100 mL、1 g ∶ 200 mL）单因素下测定黑色素纯化效果。酸纯化反应结束后，将样品置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒质量，称质量，计算杂质脱除率，评价各条件对乌鳖肌肉黑色素纯化效果的影响。

杂质脱除率=酶解残渣质量（g）-酸化残渣质量（g）酶解残渣质量（g）×100%。

（2）正交试验设计。选择盐酸浓度（G）、时间（H）、温度（I）和温度（J）作为试验因子，采用 L9（34） 正交试验条件，以杂质脱除率为评价指标，对结果进行方差分析和显著性分析，筛选最佳脱除工艺。

1.2.6 乌鳖黑色素的结构性状 （1）电镜扫描。将样品均匀散布在导电胶上，置于金属载物台，用常规真空喷镀法喷金90 s，放置于扫描电镜下观察，选取有代表性的视野进行显微拍摄。（2）傅里叶红外扫描。称取1 mg乌鳖黑色素样品、1 mg乌骨鸡黑色素样品和1 mg黑色素标准品，将样品分别与0.1 g溴化钾混合，在玛瑙研钵中研成细粉，混合均匀，用红外压片机压片。测定样品在400～4 000 cm-1 范围内的红外吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 乌鳖肌肉基本成分分析

乌鳖肌肉中测定的水分含量为77.76%，干物质含量为22.24%。乌鳖肌肉干物质的营养成分如表1所示，粗蛋白的含量高达77.56%，脂肪比例为16.85%，灰分比例为5.59%。可见，乌鳖肌肉中主要成分为蛋白质，其含有的脂肪含量也较高。因此，要对乌鳖肌肉组织进行有效的脱脂和脱蛋白工艺。

2.2 脱脂工艺优化结果

2.2.1 乌鳖肉脱脂工艺优化的单因素试验 在料液比为1 g ∶ 75 mL、回流温度为90 ℃、回流8次的初始条件下进行脱脂单因素试验，研究溶剂种类、料液比、回流次数对乌鳖肉脱脂率的影响，结果如图 1 所示，乌鳖肌肉在无水乙醇中回流8次、料液比为1 g ∶ 60 mL时的脱脂率最高。

2.2.2 乌鳖肉脱脂工艺优化的正交试验 乌鳖肌肉乙醇脱脂的正交试验结果及方差分析如表2、表3所示。根据极差R值大小，2个因素的主次顺序为B（回流次数）>A（料液比）。结合k值可知乌鳖肌肉脱脂率最高（98.99%）的条件是：料液比 1 g ∶ 60 mL、回流次数 8次。在9个试验中8号试验组为这一组合，因此A3B2组合为最优组合。根据方差分析结果可知，各因素在正交试验所选水平下对乌鳖肌肉脱脂率都有影响，但回流次数和料液比对其影响不顯著（P>0.05） 。

2.3 酶法制备黑色素工艺优化结果

2.3.1 乌鳖肉蛋白质脱除工艺优化单因素试验 在酶底比1 mg ∶ 4 g、料液比1 g ∶ 10 mL、酶解时间 4 h 的初始条件下进行黑色素酶解单因素试验。蛋白酶种类、料液比、酶解pH值、酶解温度、酶底比、酶解时间因素对乌鳖肌肉蛋白脱除效果的影响如图2所示，木瓜蛋白酶在料液比为1 g ∶ 25 mL、pH值为5.5、温度为60 ℃、酶底比为2 mg ∶ 4 g、酶解时间为6 h条件下可较大限度去除蛋白质。

2.3.2 蛋白质脱除工艺优化正交试验 根据单因素试验结果，选择木瓜蛋白酶和酶底比为2 mg ∶ 4 g为固定条件，以酶解温度（C）、酶解时间（D）、料液比（E）、酶解pH值（F）为试验因子设计L9（34）正交试验，所得结果见表4。9组试验结果中6号试验蛋白质脱除率最高，高达95.90%，相应的水平组合为C2D3E2F1。根据数据的极差R值分析结果，主次因素依次为E（料液比）>C（酶解温度）>F（酶解pH）>D（酶解时间）。结合k值进行分析可知，C2D1E2F1的组合较优异，该组合条件为：酶解温度60 ℃、酶解时间5 h、料液比1 g ∶ 25 mL、酶解pH值5.0。在此条件下，蛋白脱除率为95.98%。因此C2D1E2F1为最优组合。方差分析结果（表5）表明，各因素在正交试验所选水平下对乌鳖肉的蛋白脱除率都有影响，酶解温度、酶解时间、料液比和pH值对其影响显著（P<0.05）。

2.4  酸法纯化工艺优化结果

2.4.1 杂质脱除工艺优化单因素试验 酸化时间（G）、 酸化温度（H）、 盐酸浓度（I）和料液比（J）对乌鳖黑色素粗品杂质脱除率的影响如图3所示，9 mol/L HCl溶液、温度100 ℃、料液比1 g ∶ 20 mL条件下磁力搅拌24 h，乌鳖黑色素的杂质脱除率最大。但盐酸浓度为9 mol/L及以上时，易爆塞、溶液溅出，危险性大，因此选择6 mol/L。

2.4.2 杂质脱除工艺优化正交试验 杂质脱除工艺优化的正交试验结果如表6所示，方差分析见表7，9组中以2号蛋白质脱除率最高（71.52%），相应的组合为G2H1I2J3，即盐酸浓度为6 mol/L、料液比为1 g ∶ 15 mL、 时间为4 h、温度为100 ℃。通过对数据极差R值分析可知，影响脱除率的的主次因素依次为H（料液比）>J（酸化温度）>I（酸化时间）>G（HCl浓度）。结合k值分析结果可知，G3H1I2J3的组合更佳，经验证，该组合的蛋白质脱除率为71.84%，与G2H1I2J3的脱除率差异较小，同时考虑到盐酸浓度越高，其腐蚀性越强，操作时对人体的危险系数大，因此最佳组合选择G2H1I2J3。根据方差分析结果（表7）可知，在正交试验所选水平下，各因素对黑色素粗品杂质脱除率都有显著影响 （P<0.05）。

[7]Yao-Ching H，Vasyl M S，Svetlana Y M，et al. Antioxidant activity of melanins derived from tea：comparison between different oxidative states[J]. Food Chemistry，2002，78（2）：233-240.

[8]Rageh M M，El-Gebaly R H. Melanin nanoparticles：antioxidant activities and effects on γ-ray-induced DNA damage in the mouse[J]. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2018，828（2）：15-22.

[9]El-Naggar N A，El-Ewasy S M.Bioproduction，characterization，anticancer and antioxidant activities of extracellular melanin pigment produced by newly isolated microbial cell factories Streptomyces glaucescens NEAE-H[J]. Scientific Reports，2017，7（2）：1-19.

[10]张吉祥，赵文静，白晓杰，等. 正交试验法优化黑米黑色素的超声辅助提取工艺[J]. 食品科学，2010，31（4）：39-41.

[11]李红姣，李巨秀，赵 忠. 响应面试验优化超声波辅助提取山杏种皮黑色素工艺及其抗氧化活性[J]. 食品科学，2016，37（18）：26-33.

[12]张艳荣，王庆庆，刘 通，等. 木耳黑色素碱法提取工艺优化及表征[J]. 食品科学，2016，37（12）：27-32.

[13]张小林，陈博文，孙晓瑞，等. 响应面法优化超声波辅助灵芝黑色素提取工艺[J]. 核农学报，2018，32（3）：532-538.

[14]薛辉利，何中央，张海琪，等. 清溪乌鳖养殖性能的初步研究[J]. 中国水产，2009（6）：42-43.

[15]张海琪，何中央，徐晓林，等. 中华乌鳖的营养成分研究[J]. 中国水产，2008，7（6）：76.

[16]杨 弘，夏德全，吴婷婷，等. 中华鳖同工酶研究[J]. 中国水产科学，1997，4（4）：55-59.

[17]张海琪，何中央，邵建忠. 中华鳖培育新品种群体遗传多样性的比较研究[J]. 经济动物学报，2011，15（1）：39-46.

[18]Liu Y，Simon J D. Isolation and biophysical studies of natural eumelanins：applications of imaging technologies and ultrafast spectroscopy[J]. Pigment Cell Research，2003，16（6）：606-618.

[19]蔡华珍，张 丽. 蛋白酶法提取乌骨鸡黑色素的研究[J]. 肉类工业，2005，8（12）：24-26.

[20]刘永忠，何满莲，吴 莉. 酸提法提取乌骨鸡黑色素的研究[J]. 安徽农业科学，2009，37（31）：15256，15258.

[21]Tu Y G，Xie M Y，Sun Y Z，et al. Structural characterization of melanin from black-bone silky fowl （Gallus gallus domesticus Brisson）[J]. Pigment Cell & Melanoma Research，2009，22（1）：134-136.

[22]張恒业，李 欣，岳晓禹.乌骨鸡黑色素的分步酶解法制备及其性能研究[J]. 食品科学，2011，32（24）：55-59.

[23]黄宇玫，田颖刚，朱 胜.乌骨鸡黑色素三步法提取及结构性状研究[J]. 食品工业科技，2014，35（1）：249-253.

[24]王高富，蒋 婧，付 琳，等. 酉州乌羊皮肤黑色素含量和结构分析[J]. 黑龙江畜牧兽医（下半月），2019，5（10）：35-38.

[25]张莲姬，崔泰花. 泥鳅鱼皮黑色素提取工艺的研究[J]. 江苏农业科学，2009，3（5）：263-265.

[26]杨 慧，陈德经，夏冬辉，等. 大鲵皮肤色素提取工艺及抗氧化研究[J]. 天然产物研究与开发，2019，31（5）：887-894.

[27]王建波，刘恒旭，李鑫佳，等. 海参黑色素的提取及其结构性质研究[J]. 食品科技，2019，44（4）：255-260.

[28]于文超，何 成，武长路，等. 长牡蛎（Crassostrea gigas）贝壳与外套膜中黑色素的提取和鉴定[J]. 海洋与湖沼，2015，46（4）：909-914.庄 苑，冯艳，赵佳伦，吴芳芳，孔德政 . 不同保色剂对荷花压花颜色的影响[J]. 江苏农业科学，2020，48（24）：189-193.