抗大口黑鲈弹状病毒中草药的筛选及抗病毒效果

杭小英 袁雪梅 吕孙建 张海琪 刘莉 于喆 施伟达

摘要：采用MTT法，选择黄芪多糖、白花蛇舌草、金银花、葡萄糖酸锌、板蓝根、白芍、连翘及黄藤素8种中草药对大口黑鲈弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV）进行体外抗病毒试验，并挑选黄芪多糖，利用荧光定量PCR方法研究其对病毒复制和宿主细胞内凝集素基因（Intelectin）表达的影响。体外抗病毒试验结果显示，黄芪多糖抗MSRV效果最好，兼具显著的阻断、抑制和中和病毒的效果，其最高阻断作用率为59.13%，最高抑制率为21.64%，最高中和率为105.46%。同时，黄芪多糖还可以抑制MSRV的复制，上调细胞Intelectin基因的表达。另外，连翘、金银花和白芍对MSRV分别有显著的阻断作用（阻断作用率为16.92%）、抑制作用（抑制率为21.64%）、中和作用（中和率为54.01%）。结果表明，黄芪多糖相较试验中其他中草药制剂具有更好的抗MSRV效果，可为MSRV的药物防控提供参考。

关键词：大口黑鲈;弹状病毒;中草药;黄芪多糖;MTT法;抗病毒试验;Intelectin基因

中图分类号： S941.41+9  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）14-0155-05

大口黑鲈（Micropterus salmoides），别称加州鲈、黑鲈，是太阳鱼科黑鲈属鱼类，主要栖息在温暖区域的湖泊与池塘[1]。大口黑鲈人工繁殖于1983年成功，因其味道鲜美、无肌间刺，富含蛋白质，深受消费者的喜爱，现已推广到浙江省、江苏省和广东省等20多个省（市）。据《2019中国渔业统计年鉴》报告，大口黑鲈2018年全国的养殖产量达约43.2万t，成为我国优质的特种淡水养殖品种[2]。

近几年，随着大口黑鲈养殖行情的上升，养殖面积的扩大，暴发性疾病也在不断发生，其中有一种疾病常在鲈鱼幼苗阶段暴发，传染性强，且死亡率极高。苗种和养殖企业常用抗菌药物进行治疗，但没有效果[3]。学者们通过对发病池塘的病鱼进行采样分析，确认引起大口黑鲈鱼苗出现大规模死亡的疾病为弹状病毒病。该病病原为RNA病毒，名为大口黑鲈弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，简称MSRV），病毒粒子大小约为53 nm×140 nm，形似子弹，故名弹状病毒[1]。该病不仅可以通过养殖水体进行水平传播，也可以通过亲鱼繁殖进行纵向传播，极容易传染，且往往出现病鱼后一周内全部死亡，给养殖户造成巨大的经济损失[4-5]。

中草药（Chinese herb medicine）因富含苷、有机酸、多糖、生物碱、鞣质和黄酮类等有效成分[6]，成为我国传染水产病害防治的主要手段之一。相较于西药，中草药作为药剂具有副作用小，对养殖环境影响小，不激发药源性疾病等优势，且能通过不同作用机制对病毒产生抑制作用，如阻断病毒与细胞表面受体结合，抑制病毒核酸的复制、转录及蛋白合成，抑制病毒释放等[7]。Wang等发现，表没食子儿茶素没食子酸酯能阻断草鱼呼肠孤病毒与细胞表面的受体蛋白结合，从而达到抑制病毒的感染目的[8]。Wang等研究发现，表没食子儿茶素没食子酸酯也能抑制白斑综合征病毒的感染[9]。此外，研究表明中草药制剂还可以提高机体的非特异性免疫水平，甚至诱发机体产生干扰素，从而达到抵抗病毒感染的目的。Haetrakul等发现，注射扭序花叶片提取物可以提高鲤鱼对CyHV-3的抗性[10]。Balasubramanian等发现，斑节对虾食用含有印度木橘、苦瓜和狗牙根提取物的饲料后，其对白斑综合征病毒的抗性作用得到了显著提高，其中食用含 100 mg/kg的狗牙根水提取物的饲料可以使斑节对虾攻毒存活率达100%[11]。

本研究在结合传统中草药理论及相关抗病毒药物研究的基础上，筛选出黄芪多糖、连翘、板蓝根等8种中草药，测定以上中草药对MSRV的体外抑制作用，从中筛选出有效的抗MSRV中草药，旨在为大口黑鲈弹状病毒病防治提供可行且符合市场要求的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用大口黑鲈鱼苗购自浙江省湖州市某养殖场，MSRV毒株及草鱼卵巢细胞（CO）均由笔者所在单位鱼病研究室分离培养保存，黄芪多糖、连翘等中草药购自陕西森弗高科实业有限公司。M199培养基、胎牛血清、细胞生长液、双抗（青霉素 100 IU/mL、链霉素100 μg/mL）、胰蛋白酶均购自Gibco公司;MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;TRIzol总RNA 提取试剂、反转录和qRT-PCR荧光定量检测试剂购自 TOYOBO公司。

1.2 试验方法

本研究于2019年1月开始，相关试验均在浙江省淡水水产研究所重点实验室完成。

1.2.1 病毒滴度的测定 病毒滴度检测按照实验室常规方法[12]进行，CO细胞用胰酶消化后，按照 1×105/孔的密度加到96孔板，25 ℃培养12 h，待测病毒经10倍梯度稀释后，加入96孔板中，每孔添加量為100 μL细胞悬液，每个稀释度做8孔重复，同时设正常细胞为阴性对照，连续观察5 d。根据病变情况，按 Karber 氏法计算半数组织培养感染剂量（TCID50）[13]。

1.2.2 黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌等8种中草药对CO细胞安全浓度的测定 将8种中草药分别溶解于双蒸水，经0.22 μm滤膜除菌后保存于4 ℃备用。采用CPE法测定黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌、板蓝根、连翘、白芍、黄藤素及白花蛇舌草等8种中草药对CO细胞的最大安全浓度。将药物倍比稀释后接种于96孔板中的CO细胞，每个稀释度做4个重复，另设1组正常细胞对照，25 ℃培养96 h，取不引起细胞病变的最大浓度为该药物的安全浓度。

1.2.3 黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌等8种中草药对MSRV的阻断作用测定 在安全浓度基础上将8种中草药分别倍比稀释成4个稀释度，加到长成单层CO细胞的96孔板中，按每孔100 μL添加各浓度药物，每个稀释度做4孔重复孔。在25 ℃孵育4 h后吸走各孔药物，另加入100 μL 100 TCID50的病毒液，于25 ℃吸附1.5 h，随后吸去病毒液，加入细胞维持液，另设细胞对照和病毒对照。25 ℃细胞培养箱中培养，每日观察CPE，当病毒对照CPE达到“+ + +”“+ + + +”时，记录CPE情况，并测定96孔板中细胞的活性，计算药物的作用率。

1.2.4 黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌等8种中草药对MSRV的抑制作用测定 待96孔细胞培养板中的CO细胞长成单层后，按每孔100 μL的添加量接种100 TCID50的病毒液，于25 ℃吸附1.5 h，弃去病毒液，加入安全浓度范围内倍比稀释的中药提取物，每孔100 μL，每个稀释度做4孔重复，另设细胞对照和病毒对照。25 ℃培养，记录方法同“1.2.3”节，并用MTT法检测细胞存活量，并计算抑制率，方法和公式同“1.2.3”节。

1.2.5 黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌等8种中草药对MSRV的中和作用测定 将8种中草药安全浓度范围内4个稀释度的药液分别与等体积 100 TCID50 病毒液混合，25 ℃作用2 h，加到长成单层CO的96孔细胞培养板上，每孔100 μL，每个稀释度做4孔重复，另设细胞对照和病毒对照。25 ℃ 中培养，记录方法同“1.2.3”节，用MTT法检测细胞存活量，计算中和作用率，方法和公式同“1.2.3”节。

1.2.6 黄芪多糖对病毒复制的影响 分别按照“1.2.3”“1.2.4”“1.2.5”节中的方法进行处理，分为阻断试验组、抑制试验组和中和试验组，同时设计等剂量病毒感染CO细胞的病毒对照组和正常细胞对照组。于病毒接种后6、12、24、48、72 h收集细胞病毒液，TRIzol提取总RNA，反转录参照TOYOBO公司的“ReverTra Ace qPCR RT Master Mix”试剂盒合成cDNA。应用引物MSRV-F/MSRV-R对样品cDNA进行Real-time PCR扩增，反应体系及程序参考之前的研究方法[4]。通过标准曲线换算得到样品中病毒基因组的拷贝数。

1.2.7 黄芪多糖对CO细胞Intelectin表达的影响 按照“1.2.6”节所述步骤处理样品，分别用引物Intelectin-F/Intelectin-R及β-actin-F/β-actin-R对样品cDNA进行Real-time PCR，反应体系及程序参考之前的研究方法[4]。通过软件利用2-ΔΔCT方法计算各组Intelectin表达量相对于对照组的倍数关系。各试验组和细胞对照组之间Intelectin基因的表达差异分析方法参照“1.2.6”节进行。

1.2.8 数据分析 各试验组与病毒对照组之间的差异用SPSS 16.0中的单因素方差分析法（One-way ANOVA）进行分析。

2 结果与分析

2.1 MSRV TCID50

通过试验测得MSRV 滴度为108 TCID50/mL。

2.2 8种中草药对CO细胞的安全浓度

采用CPE方法，测得黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌、板蓝根、白芍、白花蛇舌草、连翘及黄藤素8种中草药对CO细胞的安全浓度分别为12.500、0.049、0.003、1.560、0.049、3.130、0.012、3.125 mg/mL。

2.3 8种中草药对MSRV的阻断作用效果

8种中草药对MSRV的阻断作用检测结果见表1，对病毒阻断效果最好的中草药为黄芪多糖，其最高阻断作用率为59.13%，其次为连翘，最高阻断作用率为16.92%，其他中草药未表现出明显的病毒阻断作用。

2.4 8种中草药对MSRV的抑制作用效果

试验测得黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌等8种中草药对MSRV的抑制作用率结果见表2，对病毒抑制效果最好的中草药为黄芪多糖，其最高抑制率为63.68%，其次为金银花，最高抑制率为21.64%，其他中草药未表现出明显的病毒抑制作用。

2.5 8种中草药对MSRV的中和作用效果

试验测得黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌等8种中草药对MSRV的中和作用率结果见表3，结果显示黄芪多糖、白芍及白花蛇舌草对病毒均有一定的中和作用，其中中和作用最好的是黄芪多糖，最高中和率可达105.46%，其次是白芍，最高中和率为54.01%，其他中草药未表现出明显的病毒中和作用。

2.6 黄芪多糖对MSRV复制的影响

试验结果见图1，自24 h起，各试验组病毒的拷贝数均低于病毒对照组，但差异不显著（P>0.05）。

2.7 黄芪多糖对CO细胞Intelectin基因表达的影响

从图2可以看出，各试验组Intelectin基因的表达量均出现一个先升高再降低的趋势，其中24 h时

各试验组细胞Intelectin基因表达量均极显著高于细胞对照组（P<0.01），中和试验组在48、72 h时Intelectin的表达量仍极显著高于细胞对照组（P<0.01）。

3 讨论与结论

大口黑鲈弹状病毒病于2015年在浙江地区发现，主要感染对象为大口黑鲈，在亲鱼及幼苗中均能检测到该病毒，且主要在幼苗阶段发病，具有极高的死亡率[1]。中草药提取物具有天然结构，生物活性较为完整，已被证实不仅能够促进动物生长、调节机体新陈代谢和免疫力，还能提高机体的抗感染能力[6，14]。本研究选取黄芪多糖、金银花、葡萄糖酸锌、板蓝根、白芍、白花蛇舌草、连翘及黄藤素8种中草药进行体外抑制病毒测试，结果显示黄芪多糖对MSRV具有較高的阻断、抑制和中和效果。另外，连翘对MSRV也有一定的阻断效果，金银花对该病毒有一定的抑制和中和效果，但均不如黄芪多糖明显。本研究验证了以上4种中草药的抗病毒效果，但黄芪多糖、连翘、金银花和白芍对MSRV的抑制机制不同，这与已有的研究结果一致。

连翘为木樨科植物，其主要成分连翘酯苷药理作用广泛，其中抗病毒疗效尤为显著，对多种病毒均有一定的抑制效果，包括呼吸道合胞病毒[15]、腺病毒[16]、流感病毒[17]和疱疹病毒[18]等。田文静等发现，连翘水提液能够明显抑制呼吸道合胞病毒[15]。王岌等用MTT法也观察到连翘在HEPG2细胞中也能抑制呼吸道合胞病毒的复制[19]。本研究显示，连翘对MSRV主要表现为阻断效果，推测其可能抑制了病毒衣壳蛋白与细胞受体蛋白结合的过程。刘颖娟等也发现，连翘有效成分在细胞上对单纯疱疹病毒的复制能起到阻断和抑制的作用[18]。金银花对MSRV主要表现为抑制作用，可能参与了细胞对MSRV病毒的复制及病毒颗粒装备过程的抑制作用。金银花曾被证明能够抑制合胞体病毒，金银花中绿原酸可以下调细胞TLR3、TBK1和p-IRF3蛋白，从而起到良好的抗病毒作用[20]。张旋等也证实，金银花对呼吸道合胞病毒的生物合成具有抑制作用[21]。另外，白芍也对MSRV具有一定的抗病毒作用，主要表现为体外能够中和病毒，肖尚喜等发现，白芍总苷可以提高IFN效价，具有抗病毒作用，能使水泡性口炎病毒效价显著下降[22]。

以上3种中草药提取物均表现出一定的抗MSRV活性，但均不如黄芪多糖对MSRV的作用效果明显，黄芪多糖对MSRV的最高阻断作用率为59.13%，最高抑制率为63.68%，最高中和率为105.46%，均明显高于其他中草药提取物。另外，荧光定量结果显示，黄芪多糖在作用24 h后也表现出对MSRV的复制有一定的抑制作用，虽然差异不显著。黄芪多糖具有较宽的抗病毒谱，对流感病毒、柯萨奇病毒、疱疹病毒和乙型肝炎病毒等病毒有明显的抗性[23]。李丽娅等发现，黄芪多糖能抑制通过滴鼻感染上流感病毒的小鼠出现明显的肺炎和病毒增殖[24];黄芪总皂苷、总多糖和总黄酮则在体外试验中表现出对HSV-2333株疱疹病毒的多种抗病毒效应，包括杀灭、阻断，甚至是直接抑制病毒增殖[25];杨洁等研究表明，黄芪多糖能够抗多株柯萨奇病毒（CVB-A16、CVB-B1、CVB-B3和CVB-B4），其水提液可抑制该病毒敏感细胞系中的病毒增殖[26]。邹宇宏等研究发现，黄芪总苷在抑制乙肝病毒HBV-DNA转染HepG2-2.2.15细胞表面分泌HBsAg和HBeAg的同时，还能抑制细胞增殖[27]。以上研究均说明黄芪多糖兼具阻断感染、抑制病毒增殖和中和病毒的作用，本研究结果与之一致。进一步研究发现，黄芪多糖还可以显著提高CO细胞Intelectin基因的表达水平，而该基因主要参与细胞对病原微生物的识别、启动机体的免疫防御等过程。Podok 等发现，用CyHV-2感染异育银鲫后，鱼体的Intelectin基因表达量显著上调，推测其可能参与了病毒的识别过程[28];Gu等也发现，该基因参与了病毒性脑炎诱导的机体免疫反应[29]。

本研究首次筛选了抗MSRV的中草药，黄芪多糖、连翘、金银花和白芍均对MSRV表现出不同机制的抗病毒作用，其中黄芪多糖的作用效果最为显著。该研究结果可为后续抗大口黑鲈弹状病毒及其他病毒药物的筛选提供理论依据。

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