秋石斛抗寒性生理的综合评价

林榕燕 钟淮钦 方能炎 林兵 叶秀仙

摘要：为建立秋石斛抗寒性生理综合评价体系，选取6个秋石斛品种为材料，测定各品种的叶片相对电导率，结合 Logistic 方程计算半致死温度（LT50），同时测定抗寒性相关生理指标[叶绿素含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙二醛（MDA）含量、保护酶活性等]，通过相关性及主成分分析，选用相对电导率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量这5个指标，利用隶属函数分析法综合评价供试秋石斛抗寒性。结果表明，秋石斛不同品种的LT50大小依次为D117、四面佛、三亚阳光、D128、香江美人和水芙蓉，说明水芙蓉在供试品种中抗寒性较强。隶属函数分析法评价结果显示，水芙蓉和香江美人为高抗寒品种，D128为低抗品种，三亚阳光、四面佛和D117为不抗品种，综合评价的结果与LT50结果和越冬条件下的田间观测结果基本吻合，说明了该综合评价体系的可行性。本研究初步建立了秋石斛抗寒性生理综合评价体系，为进一步开展秋石斛抗寒机理研究奠定了基础。

关键词：秋石斛;抗寒性;半致死温度（LT50）;生理指标;相关性分析

中图分类号： S682.310.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）09-0111-06

秋石斛（Dendrobium spp.）为兰科石斛属多年生植物，花型优美、色彩丰富、花期较长，不仅可作为切花材料，也是重要的盆花品种，在国际花卉市场上占有一席之地[1]。但秋石斛的生长期对温度和湿度要求较高，过高或过低的温度都有可能使其停止生长[2]。在我国，仅有部分地区可以生产秋石斛，如福建、海南、云南等地，但这些地区仍无法完全满足秋石斛的生长，冬季低温的影响不容忽视[3]。低温不仅造成秋石斛切花产量和品质下降，还影响到来年的生产[4]。因此，低温被普遍认为是秋石斛推广应用的最大限制因素。

提高秋石斛的抗寒性以降低冬季低温伤害是秋石斛产业亟须解决的主要问题，而获得高抗寒性的秋石斛品种则是解决该问题的关键。但目前常规杂交育种方法，很难满足生产上对秋石斛抗寒品种的迫切需要[5-6]，且近年来有关秋石斛的研究多集中在离体培养技术[7-8]、花色形成机理[9]、病毒检测[10]等方面，对抗寒性机理研究相对滞后。针对这一研究现状，本研究拟开展秋石斛种质资源抗寒性生理指标分析，建立秋石斛抗寒性生理综合评价体系，解析秋石斛抗寒生理响应机制，为今后更加系统深入地研究秋石斛抗寒相关调控机理和抗寒品种的选育提供理论基础。

因此，本研究基于课题组前期的研究基础，以秋石斛在种质资源圃越冬条件下的田间性状观测为材料选择依据，选取具有抗寒表现不一的6个秋石斛品种，测定各品种叶片在低温胁迫下的相对电导率，结合 Logistic 方程计算半致死温度（LT50），同时测定了部分抗寒性相关生理指标，如叶绿素、可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性等，通过相关性及主成分分析，并综合生理指标观测结果，初步建立了秋石斛抗寒性生理综合评价体系。

1 材料与方法

1.1 材料

以福建省农业科学院作物所花卉研究中心种质资源圃保存的长势基本一致且生长状况良好的秋石斛品种（三亚阳光、四面佛、香江美人、水芙蓉、D117及D128）为试验材料。试验于2020年9月在福建省特色花卉工程技术研究中心花卉生理实验室进行。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 相对电导率测定 参照徐新娟等的方法[11]，并略作修改。相对电导率（REC）的计算公式为REC=（E1/E2）×100%，其中E1为材料处于室温条件下浸泡24 h后测量的电导率;E2为材料在测量E1后于100 ℃ 沸水浴 20 min冷却至室温后测量的电导率。

1.2.2 LT50的确定 应用 Logistic 方程y=k/（1+ae-bx）对处理温度和对应的相对电导率进行拟合，并推导 Logistic方程的二階导数并令其为0，计算出方程的拐点温度，即LT50。式中：y表示低温处理下的相对电导率;x表示处理温度;k、a和b均为方程的参数。

1.2.3 叶绿素含量的测定 参照王学奎的方法[12]，并做适当修改。以95%乙醇作为萃取液，摇匀后置黑暗处，中间摇晃几次使萃取液混合均匀，直至叶片材料完全失绿。以萃取液作为空白对照，分别在649、665 nm波长下测定提取液中叶绿素的吸光度。

1.2.4 可溶性糖、可溶性蛋白、MDA含量测定 可溶性糖含量和MDA含量的测定参照Solarbio公司相应的检测试剂盒说明书，采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA含量;可溶性蛋白含量参照南京建成科技有限公司的蛋白定量测试盒说明书，采用考马斯亮蓝法测定。

1.2.5 SOD、POD、CAT酶活性测定 3种酶活性的测定均参照相应的酶活性检测试剂盒说明书，采用氮蓝四唑法测定SOD酶活性，采用愈创木酚法测定POD活性，采取可见光法测定CAT活性。

1.2.6 抗寒性综合评价方法 对参试的9个生理指标进行相关性和主成分分析，并采用隶属函数分析法进行评价。（1）与抗寒性呈正相关的参数计算：Uij=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）;（2）与抗寒性呈负相关的参数计算：Uij=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）。

式中：Uij 为各指标的抗寒隶属函数值;Xij表示第i个秋石斛品种第j项指标测定值;Xjmax、Xjmin为供试的全部材料中第j项指标的最大值和最小值。

1.3 数据分析

采用Execl 2007和SPSS 20.0软件对文中涉及的数据进行统计、显著性分析、主成分分析及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 秋石斛不同品种低温胁迫下相对电导率的变化规律

通过比较秋石斛不同品种叶片在-10、-5、0、5、10 ℃时的相对电导率（图1），发现随着温度降低，6个秋石斛品种叶片的相对电导率均呈上升趨势，其中四面佛和D117的变化趋势较为相似，在 0 ℃ 降到-5 ℃的范围内，相对电导率上升程度最大;而三亚阳光、香江美人、水芙蓉及D128的相对电导率在-5 ℃降到-10 ℃的范围内上升最明显。

将不同处理温度间的相对电导率数据进行多重比较分析（图2-A），发现-10 ℃处理时的相对电导率最高，与其他处理温度间的相对电导率存在显著差异，而 0、5、10 ℃ 时的相对电导率间差异不显著。将6种秋石斛叶片相对电导率数据进行多重比较分析（图2-B），发现6个不同品种间的相对电导率间差异不显著。

2.2 LT50的确定

由表1可知，秋石斛不同品种的LT50高低顺序为D117、四面佛、三亚阳光、D128、香江美人和水芙蓉。其中，水芙蓉的LT50为2.73 ℃，比D117、四面佛、三亚阳光、D128、香江美人分别低了2.56、2.45、2.26、1.28、0.63 ℃，说明水芙蓉在供试品种中抗寒性最强。

2.3 秋石斛不同品种叶绿素含量的差异分析

以6个品种秋石斛叶片为材料，对叶绿素a含量、叶绿素b含量及总叶绿素含量进行分析，如图3所示，叶绿素a和总叶绿素含量分布情况基本一致，表现为水芙蓉>四面佛>D128>香江美人>D117>三亚阳光，叶绿素a含量在品种间差异不显著，总叶绿素含量在品种三亚阳光和水芙蓉间存在显著差异。叶绿素b含量的分布情况表现为水芙蓉>四面佛>香江美人>D128>D117>三亚阳光，叶绿素b含量在品种间存在显著差异，其中水芙蓉叶片中的叶绿素b含量是三亚阳光叶片中的1.70倍。

2.4 秋石斛不同品种可溶性糖和可溶性蛋白含量的差异分析

由图4-A可见，不同秋石斛品种叶片可溶性糖含量的高低排序为香江美人、水芙蓉、D128、D117、三亚阳光、四面佛，其中，香江美人的可溶性糖含量最高，与其他品种的可溶性糖含量存在明显差异，其可溶性糖含量是四面佛的1.43倍。由图 4-B 可见，不同秋石斛品种叶片可溶性蛋白含量的高低排序为水芙蓉、D128、三亚阳光、D117、香江美人、四面佛，其中，水芙蓉的可溶性蛋白含量最高，与其他供试品种的可溶性蛋白间均存在显著性差异，其可溶性蛋白含量是四面佛的2.00倍。

2.5 秋石斛不同品种MDA含量的差异分析

通过比较不同品种叶片MDA含量（图5），发现MDA含量的高低排序为香江美人、D128、水芙蓉、D117、四面佛、三亚阳光，其中，香江美人的MDA含量最高，与其他供试品种的MDA含量均存在显著性差异，其MDA含量是三亚阳光的1.55倍。

2.6 秋石斛不同品种叶片相关酶活性的差异

由图6可以看出，SOD、POD、CAT这3种酶活性在不同品种中高低排序存在一定差异。由图6-A可见，D117的SOD酶活性显著高于其他供试品种，而香江美人的SOD酶活性显著低于其他供试品种，D117的SOD酶活性是香江美人的2.44倍。由图6-B可见，D117的POD酶活性显著高于其他供试品种，其POD酶活性是三亚阳光的1.40倍。由图6-C可见，香江美人和水芙蓉的CAT酶活性显著低于D117、D128和三亚阳光，香江美人的CAT酶活性仅为D128的55.48%。

2.7 参试生理指标间的相关性分析与主成分分析

由表2可知，LT50与相对电导率、CAT活性、POD活性、SOD活性存在正相关关系，其中与相对电导率存在极显著正相关关系;LT50与可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、总叶绿素含量和MDA含量负相关，其中与可溶性糖含量显著负相关。同时，可溶性糖含量与相对电导率和CAT活性存在显著负相关关系，与MDA含量存在显著正相关关系;CAT活性和SOD活性存在显著正相关关系。由于LT50越高，抗寒性越低，说明与抗寒性呈正相关的指标有可溶性糖、可溶性蛋白、总叶绿素含量和MDA含量;与抗寒性呈负相关的指标有相对电导率、CAT活性、POD活性、SOD活性。

对测试的生理指标进行主成分分析，由表 3 可知，前2个主成分合计解释了78.574%的方差，其中第1主成分的贡献率为58.775%，反映了LT50、相对电导率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量等成分的信息;第2主成分的贡献率为19.799%，主要反映了可溶性蛋白含量的信息;说明LT50、相对电导率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量这6个指标可以用作秋石斛抗寒性评价的指标。

2.8 抗寒性生理综合评价体系的建立

为了较全面地反映秋石斛的抗寒性，选用相对电导率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量这5个指标，通过平均隶属度来综合评价供试秋石斛品种的抗寒性。由表4可知，香江美人和水芙蓉为高抗寒品种;D128为低抗品种;而三亚阳光、四面佛和D117为不抗品种，综合评价的结果与LT50的结果基本一致。

3 讨论与结论

植物抗寒性受环境和遗传的影响，其机制研究是一个非常复杂的过程[14-15]。当前，用来反映植物抗寒性的评价指标有生理生化指标、形态结构和基因蛋白等，用来鉴定植物抗寒性较为常用的方法有田间直接鉴定法、LT50评价法、隶属函数分析法等[16-19]。本研究主要利用LT50评价法和隶属函数分析法对供试的秋石斛品种进行抗寒性评价。

LT50评价法应用 Logistic 方程对处理温度和对应的相对电导率进行拟合，得到几种供试秋石斛品种的抗寒性大小为水芙蓉>香江美人>D128>三亚阳光>四面佛>D117。隶属函数分析法综合了相对电导率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量等抗寒相关的多个生理指标对供试秋石斛抗寒性进行评价，其评价结果与LT50评价法鉴定结果基本一致，说明本研究采取的评价方法具有一定的可靠性。

在分析过程中，以LT50作为参考指标，发现与秋石斛抗寒性具有较强相关性的指标有相对电导率、CAT活性、SOD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量，其中可溶性糖含量和可溶性蛋白含量与抗寒性呈正相关关系，这一研究结果与蔷薇抗寒性研究结果[20]一致;而相对电导率、CAT活性、SOD活性與抗寒性呈负相关关系，这一结果与石榴[21]、球根花卉[22]、狗牙根[23]等抗寒研究结果相符。值得一提的是，2个评价方法中都利用到了相对电导率这一指标。有研究表明，相对电导率在一定程度上反映了膜脂的损伤程度，与抗寒性呈负相关关系，这是因为低温条件下，细胞膜透性增加，电解质外渗加大，相对电导率升高[24-25]。本研究中，四面佛和D117的相对电导率在0 ℃降到-5 ℃的范围内上升程度最大;而三亚阳光、香江美人、水芙蓉及D128的相对电导率在-5 ℃降到-10 ℃的范围内上升最明显，说明四面佛和D117的抗寒性在供试品种中较弱，也表明相对电导率可在一定程度上体现植物的抗寒性，但无法反映某一具体品种的抗寒性。

综上，通过LT50评价法和隶属函数分析法，本研究初步建立了秋石斛抗寒性生理综合评价体系，供试的6个秋石斛抗寒性大小为水芙蓉>香江美人>D128>三亚阳光>四面佛>D117。但在现阶段的抗寒研究中，能用来反映植物抗寒性的生理指标还有很多，为了更加系统地研究秋石斛的抗寒性机理，笔者所在课题组下一步将通过测定不同低温胁迫条件下的更多生理指标，对综合评价体系进行优化，并在此基础上，利用转录组测序技术，挖掘出调控秋石斛抗寒的关键基因，揭示秋石斛响应低温胁迫的分子调控机制，为从理论上深入阐明秋石斛抗寒机理、促进秋石斛抗寒品种选育奠定基础。

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