ALA对菊花抗氧化酶系统光照胁迫效应的缓解作用

时间：2024-05-21

何培磊　叶自慧　孙延军　周厚高

摘要：以切花菊品种D3为试验材料，研究喷施0、100、200mg/L3种浓度ALA对0%、25%、50%3种光照胁迫菊花的逆境环境下抗氧化酶系统的影响。结果表明，随着遮阳程度的增加，菊花叶片内SOD、POD和CAT活性在降低，其中POD和CAT活性随着遮阳时间的延长而降低。ALA的喷施能够缓解逆境环境给菊花抗氧化酶系统带来的部分影响。

关键词：菊花;光照胁迫;抗氧化酶系统

中图分类号：S682.1+10.1文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）01-0107-05

作者简介：何培磊（1989—），男，河南信阳人，硕士，讲师，研究方向为园艺花卉学。E-mail：hplstiven@163.com。

通信作者：周厚高，博士，教授，主要从事花卉学研究。E-mail：zhouhougao@163.com。

菊花（Chrysanthemum×morifoliumRamat.）是典型的阳性植物，生产中需要良好的光照条件，在温室设施栽培中可能存在光照不足的问题，或在某些生长阶段，如在切花采切之前需要适当遮阴以提高花色的质量。本研究旨在探讨光照胁迫下菊花重要抗逆生理反应以及喷施ALA（5-氨基乙酰丙酸，5-aminolevulinicacid）处理对此类抗逆反应的缓解效应。

ALA是所有卟啉类化合物合成的关键前体，早已引起研究者们的重视[1]。ALA能够直接启动脂质过氧化反应[2]和间接启动光氧化反应[3]。ALA是一种α-氨酮，在有氧和微碱性条件下可自动烯醇化并生成O-2[KG-*3]·、H2O2和·OH等活性氧自由基[2，4]。ALA在提高植物的抗冷、耐盐性、耐弱光性上有很大的应用前景[5-6]。关于逆境对植物抗氧化酶系统方面的影响研究和报道已经有很多[7-11]，如水胁迫[7]，重金属砷、铝胁迫[8，11]，干旱胁迫对抗氧化酶系统的影响。

ALA可显著提高植物的抗逆性，缓解各种非生物逆境胁迫对植物生长、生理生化和光合作用的影响，在ALA缓解各类胁迫效应方面，近年学者们做了不少的研究，取得了一些进展[12-17]。ALA能缓解盐胁迫对喜树幼苗[12]、花椰菜幼苗[13]、黄瓜幼苗[14]抗氧化酶活性的影响，能改善NaCl胁迫下酸枣幼苗光合特性[15]，对春玉米衰老的延缓[16]，以及改善干旱胁迫下山定子[17]、早熟禾[18]叶绿素及生理状态。ALA对菊花的光合作用和生理特性的影响及对非生物逆境的缓解效应研究很少[19]，尚无对设施生产的光照逆境缓解效应的研究。本研究主要探讨菊花喷施外源ALA对光照胁迫下抗氧化酶活性的缓解效应，以期为ALA在园艺产业以及在植物抗逆性上的应用提供更多的技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验以切花菊品种D3（Chrysanthemum×morifoliumD3）为试验材料，选用健壮、无病虫害、均匀一致的扦插种苗。试验于2018年9月下旬进行，试验实施位于广州市白云区落潭镇菊花生产基地内。

1.2试验方法

试验采用3个遮阳梯度，分别为正常光照100%（CK）、中度遮阳为正常光照的50%（T1）、重度遮阳为正常光照的25%（T2）;3个ALA的喷施浓度分别为B1（0mg/L）、B2（100mg/L）、B3（200mg/L），共9个处理组处理试验菊花。将菊花苗定植于装有泥炭土和珍珠岩的花盆中（泥炭土与珍珠岩的体积比为3∶[KG-*3]1），每盆4株，每个处理组9盆。定植后正常光照恢复5d取第1次样品（d0），并测量3种抗氧化酶活性指标。在遮阳5d后，进行连续3d的喷施ALA處理，之后每10d取样1次，共取3次样（分别d10、d20、d30），并进行3种抗氧化酶活性指标的测定。

1.2.1超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（NBT法）

（1）试剂药品：0.05mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8）;130mmol/L甲硫氨酸（Met）;750μmol/L氮蓝四唑（NBT）;100μmol/LEDTA-2Na;20μmol/L核黄素。

（2）将1支暗对照管置于暗处，其余样品日光下（4000lx）反应20min（时间可自行调节，反应体系颜色变化即可）。以暗对照作空白调零，测定光对照及样品560nm处吸光度。

（3）计算SOD活性（U/g）=[（DCK-DE）·VT·D]/（0.5·DCK·W·VR）。式中：DCK为光对照管吸光度;DE为样品管吸光度;VT为酶提取液总体积，mL;VR为测定时酶液用量，mL;W为样品鲜质量，g;D为稀释倍数。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位。

1.2.2过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）

（1）试剂药品：0.05mol/L磷酸缓冲液（pH值5.5）;0.2%愈创木酚溶液;0.3%H2O2。

（2）3mL反应体系：1.0mLPBS（pH值5.5），0.95mL0.2%愈创木酚溶液，1.0mL0.3%H2O2，1.0mL0.3%H2O2，50μL酶液（酶液用量可自行调节，以吸光度在0.1～0.9间即可），最后加入H2O2或愈创木酚启动反应，可使反应体系混合更均匀。

（3）以PBSpH值5.5为对照调零，记录470nm处吸光度（以每1min增加0.01定义为1个酶活性单位）。

（4）POD活性[U/（g·min）]=（ΔD470nm·VT·D）/（0.01·W·VR·t）。式中：ΔD470nm为反应时间内吸光度的变化;VT为总的酶液提取液体积，mL;D为稀释倍数;VR为测定时的酶液体积，mL;W为样品鲜质量，g;t为反应时间，min。

1.2.3过氧化氢酶（CAT）活性测定

（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH值7.0）：取A母液（Na2HPO4）457.5mL和B母液（NaH2PO4）292.5mL混合后用蒸馏水定容至1000mL。

（2）反应液配制：取200mLPBS（0.15mol/L，pH值7.0），加入0.3092mL30%的H2O（原液）摇匀即可。

（3）样品测定：取3mL反应液加入0.1mL酶液，以PBS为对照调零，测定D240nm（紫外）（测定40s）。

（4）酶活性计算：以1minD值减少0.01为1个酶活性单位。

CAT活性[U/（g·min）]=[ΔD240nm×Vt]/（W×Vs×0.01×t）。式中：ΔD240nm为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜质量，g;t为反应时间，min;Vt为提取酶液总体积，mL;Vs为测定时取用酶液体积，mL。

2结果与分析

2.1ALA对遮阳下菊花叶片SOD活性的影响

由表1可知，在正常光照条件下，ALA的喷施对其叶片中SOD活性的影响不大。光照胁迫对SOD活性的影响是显著的，考察d10、d20、d30遮阳但未喷施ALA的处理其SOD活性随着遮阳的强度和遮阳的时间长度的增加逐步下降，效应达到极显著差异。在d10天，中度遮阳、重度遮阳处理其SOD活性分别降低24.81%、39.51%，d20分别降低28.62%、37.29%，d30分别降低30.74%、40.83%。在中度遮阳处理未使用ALA（T1）情况下，处理10、20、30d其SOD活性分别降低22.63%、26.27%、24.83%;在重度遮阳处理未使用ALA（T2）情况下，处理10、20、30d其SOD活性分别降低39.85%、37.40%、37.93%。在同等光照胁迫强度下，SOD活性比不遮阳的对照明显下降（表1中T1B1、T2B1），但不同胁迫时间长度之间差异不显著。

对光照胁迫下的菊花喷施外源ALA处理，仍然导致菊花叶片SOD活性明显下降（表1中T1B2、T1B3、T2B2、T2B3）。处理10d时快速下降，中度遮阳下喷施ALA100、200mg/L，SOD活性分别下降17.39%、9.22%，重度遮阳下分别下降34.60%、31.11%。重度遮阳处理的SOD活性下降比中度遮阳处理幅度大得多，由此可见SOD活性下降的幅度与光照胁迫的强度密切相关。观察d10、d20、d30，其中重度遮阳T2下的各时间点的酶活性降低幅度最大，比如，喷施ALA100mg/L处理T2B2各时间点与d0相比菊花酶活性分别下降34.60%、35.14%、31.35%。由此可见，即使喷施ALA，光照胁迫仍然能够使菊花叶片中的SOD活性下降，但遮阳时间长度d10到d30间对SOD活性的效果未表现出显著性差异，与没有ALA处理的T1B1、T2B1趋势一致。

盡管ALA喷施没有阻止光照胁迫导致菊花叶片SOD活性的下降，但是ALA喷施对SOD活性下降的缓解作用十分明显。在中度光照胁迫T1组，处理10d时，喷施ALA100、200mg/L，与没有喷施ALA的T1B1相比，SOD活性分别增加7.75%、21.83%，d20分别增加14.07%、23.40%，d30分别增加11.71%、21.55%。在重度光照胁迫T2组，处理10d时，喷施ALA100、200mg/L，与没有喷施ALA的T2B1的相比，SOD的活性分别增加7.80%、11.46%，d20分别增加2.72%、9.90%，d30分别增加9.65%、10.46%。

喷施效果整体表现为200mg/LALA>100mg/LALA>0mg/LALA;相比较不同的遮阳处理，ALA的喷施对于中度遮阳下菊花叶片SOD活性的影响更显著，各处理组之间表现出显著性差异，且在中度遮阳下喷施200mg/L的ALA展示的缓解效果最突出。

2.2ALA对光照胁迫下菊花叶片POD活性的影响

由表2可知，在正常光照条件下，ALA的喷施对菊花叶片中POD活性的影响不大，到后期d30体现了一定的促进作用。但光照胁迫对POD活性影响是显著的，d10、d20、d30遮阳但未喷施ALA（T1B1、T2B1）的处理POD活性随着遮阳的强度和遮阳时间长度的增加逐步下降，效应达到极显著差异。在处理10d，[JP+1]中度遮阳、重度遮阳处理SOD活性比d0分别降低20.61%、29.20%，d20分别降低28.62%、38.82%，d30分别降低34.64%、47.71%。

对光照胁迫下的菊花喷施外源ALA处理，仍然导致菊花叶片POD活性明显下降（表2，T1B2、T1B3、T2B2、T2B3）。处理10d时快速下降，中度遮阳下喷施ALA100、200mg/L处理SOD活性比d0分别下降16.14%、17.46%，重度遮阳下分别下降32.23%、19.37%。重度遮阳处理的SOD活性下降比中度遮阳处理幅度大得多，由此可见SOD活性下降的幅度与光照胁迫的强度密切相关。在中度遮阳和重度遮阳处理下，随着遮阳时间的延长，POD活性呈现出明显逐步降低，差异显著，这与遮阳对菊花叶片SOD的活性影响表现不同。观察d10、d20、d30，其中重度遮阳T2下的各时间点的酶活性降低幅度最大，比如，喷施ALA100mg/L处理T2B2各时间点与d0相比菊花酶活性分别下降23.23%、32.66%、39.72%。

不同浓度ALA喷施对POD活性下降的缓解作用不一样。在中度光照胁迫T1组，喷施ALA对光照胁迫导致的POD活性降低的缓解作用前期不明显，d20、d30时才有一定的促进作用。在重度遮阳T2组，喷施ALA对光照胁迫导致的POD活性降低的缓解作用比中度遮阳效果更明显，在处理10d观察，喷施ALA100、200mg/L，与没有喷施ALA的T2B1的相比，POD的活性分别增加9.71%、18.14%，d20分别增加11.37%、22.42%，d30分别增加16.65%、27.65%。可以发现，喷施ALA对光照胁迫导致POD活性降低的缓解作用在重度光照胁迫下，随着胁迫时间的延长，其效果更明显。

总之，喷施效果整体表现为200mg/LALA>100mg/LALA>0mg/LALA;相比较不同的遮阳处理，ALA的喷施对于重度遮阳下菊花叶片POD活性的影响更显著。

2.3ALA对遮阳下菊花叶片过氧化氢酶CAT活性的影响

由表3可知，在正常光照条件下，ALA的喷施对菊花叶片中CAT活性的影响不大。但光照胁迫对CAT活性影响是显著的，d10、d20、d30遮阳但未喷施ALA（T1B1、T2B1）的处理CAT活性随着遮阳的强度和遮阳时间长度的增加逐步下降，效应达到极显著差异。在处理10d时，中度遮阳、重度遮阳处理CAT活性比d0分别降低16.05%、35.46%，d20分别降低22.40%、47.12%，d30分别降低33.33%、61.55%。

对光照胁迫下的菊花喷施外源ALA处理，仍然导致菊花叶片CAT活性升高（表3中T1B2、T1B3、T2B2、T2B3）。处理10d时快速下降，中度遮阳下喷施ALA100、200mg/L处理CAT活性分别比不施ALA的处理T1B1升高了8.25%和近持平，重度遮阳下分别升高了5.38%、22.15%。但总体来讲，CAT活性随着光照胁迫时间延长而持续下降。

与上述SOD、POD酶活性变化不同的是，ALA的喷施对缓解光照胁迫导致菊花CAT活性下降的作用明显较弱，只在200mg/L的前期d10有所体现，随着光照胁迫时间延长，缓解效应逐步减弱，到d20、d30时期ALA的缓解作用已经消失。

3结果与讨论

外源ALA的喷施能够通过影响植物的光合作用，从而提高植物的营养生长能力，提高产量、改善品质，已经在很多的试验中获得证实，如显著提高黄瓜幼苗的全株干质量、壮苗指数和根系活力[6，14]。但是对于在非生物逆境条件下，外源ALA对逆境效应缓解作用的探讨还不多，探讨了ALA缓解喜树幼苗[12]、酸枣幼苗[15]盐害的生理机制，探讨了ALA缓解干旱对早熟禾[18]、山定子[17]以及低温对玉米幼苗[16]胁迫的生理机制，对菊花相关研究更少，仅见探讨了ALA缓解低温胁迫的光合作用和生理影响[19]。

抗氧化酶系统是逆境生理研究的重要指标，不同的非生物逆境研究都涉及到SOD、POD和CAT等活性的研究[20]。本研究发现，ALA缓解菊花光照胁迫的效应中，SOD、POD和CAT活性的反应模式是不一样的。在光照胁迫下，ALA都能使SOD、POD下降中的活性得到一定程度的回升反应，这一结果与花椰菜幼苗的研究[13]一致，该研究表明150mmol/LNaCl胁迫下，喷施10mg/LALA能够显著提高SOD、POD活性。本研究发现，光照胁迫下，在时间维度SOD活性下降幅度较小，也就是说，处理10～30dSOD活性下降较少，而POD活性在时间维度的稳定性稍差，随着胁迫时间持续，POD活性持续下降。

在酸枣种子萌发的研究发现，ALA的喷施能够减缓盐水对酸枣种子的胁迫作用，明显提高CAT、SOD、POD活性和MDA含量[15]。而本研究发现，ALA对光照胁迫下缓解CAT活性下降有一定效果，但不如在酸枣幼苗中的作用显著，且效应的持续性差。

本研究从ALA浓度和持续时间2个维度观察了在光照胁迫下，ALA对菊花叶片抗氧化酶活性的缓解效应，发现了CAT、SOD、POD不一样的反应模式，特别是在时间维度ALA的效果持续性方面，3种酶的反应不同，而这方面的研究目前还不多。今后将在ALA浓度梯度和时间长度方面进一步拓展，在农艺性状到分子机制不同层面加强研究，为生产应用提供更多的资料。

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