植物病毒病检测及防治的研究进展

娄 虎， 徐 熔， 王海竹， 徐启江

(东北林业大学生命科学学院/林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040)

据报道，每年仅在我国由于病毒感染农作物造成的损失可达200亿美元，植物病毒病引起的损失是世界人口生存的威胁之一[1-2]。植物病毒病检测方法包括形态学方法(生物学检测法、电子显微镜法)、免疫学方法[酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)、免疫荧光检验法(immunofluorescence，IF)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、电印迹免疫分析(electro-bot immuno assay，EBIA)]、分子生物学方法[聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)、逆转录PCR(reverse transcription PCR)、多重逆转录聚合酶链反应(multiplex RT-PCR)、逆转录实时定量PCR(reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)、微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)、免疫沉淀反转录PCR(immunoprecipitation reverse transcription PCR，IP-RT-PCR)、原位RT-PCR]和纳米生物传感器技术。植物病毒病防治策略包括农业措施、抗病育种(茎尖脱毒繁育无病毒苗木、植物病毒基因工程)、化学药剂防治(植物病毒天然抑制剂、化学合成抑制剂)、弱毒疫苗接种技术。

研究者对各种方法在时效性、可操作性、准确性、灵敏度等方面持有不同态度，Nam等利用多重RT-PCR技术检测出SLV(shallot latent virus)、LYSV(leek yellow stripe virus)、GCLV(garlic common latent virus)、Allexivirus、OYDV(onion yellow dwarf virus)等5种大蒜病毒[3]；Hu等利用多重RT-PCR技术检测出SLV、LYSV、OYDV、Allexivirus等4种大蒜病毒，且取1 μL以1 μg RNA反转录的cDNA稀释10 000倍时仍能够出现清晰的条带[4]；袁青等利用二重RT-PCR检测出马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)和马铃薯A病毒(potato virus A，PVA)2种病毒，且在2种下游引物(PVX、PVA)体积比为0.4 ∶1.0时RT-PCR反应的效果最好，无非特异性条带[5]；董代幸等则利用一步法多重RT-PCR同时检测出PVX、PVY(potato virus Y)、PLRV(Potato leaf roll virus)、PVA等4种马铃薯病毒，探索了Taq酶浓度对多重RT-PCR效果的影响，且Taq酶浓度最低为 5 U/μL 时可以出现清晰的条带，总RNA的最低检测浓度为7.8 μg/L时可扩增出产物[6]。利用RT-PCR技术只能检测出常见的病毒，此法对PCR引物的设计具有较高的依赖性，研究者对多重PCR反应中的产物能否同时检测出不同病毒仍然持有争议，有待于探索新方法对此进行进一步验证。

1 植物病毒的检测方法

1.1 形态学方法

形态学方法主要包括生物学检测法和电子显微镜法。

生物学检测法是借助于对某些病毒敏感的植物而进行的病毒鉴定方法，指示植物是指对某一种或某几种病毒及类病毒具有敏感反应，一旦被感染能很快表现出明显症状的植物。随着研究者对植物病毒的深入研究，从病毒感染的植株宏观表型上很难分辨出病毒的种类，因此电子显微镜逐渐应用于植物病毒的检测中。电子显微镜法是将染病组织制样，可根据病毒的形态、大小、内含体及染病组织超微结构等用来诊断病毒的种类，分辨率可达0.1 nm，而病毒粒体大小为10～100 nm。Shapiro等利用电子显微镜对珊瑚的形成进行微观的观察研究，对珊瑚的钙化、形成等机制进行了探讨[7]；de Souza等利用电子显微镜对凤梨科观赏植物进行组织观察分析，为观赏植物的组织培养及发育的分子机制奠定了基础[8]；肖英等详细介绍了电子显微镜对植物病毒检测的步骤及研究方法，最常用的方法为负染色技术和超薄切片技术[9]；Henderson等利用超微电子显微镜对微藻的结构进行了细致的观察和分析[10]。对植物病毒的检测，即使寄主植物的病毒含量极低，电子显微镜也可以进行有效的检测，利用电子显微镜与其他检测方法相结合检测效果更好。

1.2 免疫学方法

1.2.1 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验是一种固相吸附和免疫酶技术相结合的方法，将抗原和抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行，并借助结合在抗体或抗原上的酶与底物反应所产生的颜色变化来检测病毒。Li等对酶联免疫吸附原理改进后检测了大麦黄矮病毒属(Barley yellow dwarf virus，BYDV)GPV、GAV、PAV、RMV等4个株系病毒，且将叶提取物检测浓度稀释至0.195 g/L后仍能够明显地检测出结果[11]；Charoenvilaisiri等将RT-PCR和酶联免疫吸附技术相结合(RT-PCR-ELISA技术)，检测出辣椒黄矮病毒(capsicum chlorosis virus，CaCV)、甜瓜斑点病毒(melon yellow spot virus，MYSV)、番茄致死环斑病毒(tomato necrotic ringspot virus，TNRV)和西瓜银色斑点病毒(watermelon silver mottle virus，WSMoV)等4种病毒，且RT-PCR-ELISA技术检测的灵敏度是普通RT-PCR技术的 10～1 000倍[12]；Zang等利用酶联免疫吸附原理结合传感器介绍了检测烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)的新方法，微传感器的最低检测浓度达到了9.1 ng/mL[13]。

1.2.2 免疫荧光检验法 免疫荧光检验法是一种利用显微技术与免疫中抗原抗体的特异性原理检测病原体感染的植物组织，将植物组织样品制成组织薄片于载玻片上，通过结合特定抗体的荧光染料来实现可视化目标的分布，根据荧光显示病毒的质粒形态、大小、内含体等诊断病毒种类，此法同样可以结合荧光原位杂交技术共同检测病毒以便提高检测灵敏度，Wullings等结合这2种方法检测出马铃薯中的病毒[14]。免疫荧光检测法、荧光原位杂交等荧光显微技术面临的重要问题是存在光漂白现象，即光漂白造成的荧光减弱或不可恢复性荧光消失，可以通过控制激发光照度、曝光的持续时间、增加荧光团的浓度等方法进一步增加检测方法的灵敏度。

1.2.3 荧光原位杂交 荧光原位杂交技术是把显微镜技术、荧光技术、DNA分子杂交技术相结合的植物病毒检测方法，植物中含有病原体的核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)用于识别病原体rRNA的分子探针在荧光原位杂交技术中能够检测出感染植物病毒的种类及含量。荧光原位杂交技术具有较高的灵敏度和特异性，对病原体保守的rRNA序列具有特异性的识别与结合。Shargil等利用FISH技术检测出黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)，在植物组织中可形成清晰、光亮的荧光，使植物病毒检测的直观性、特异性、准确性更高[15]；Kliot等利用FISH技术在植物组织及昆虫体内成功定位出番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)的位置，为植物病毒病及昆虫传播的防治提供技术支持[16]。可靠性好的FISH技术高度依赖于核苷酸探针的特异性，探针特异性不强、发夹结构等均是须要解决的问题。

1.2.4 电印迹免疫分析 电印迹免疫分析法首先要提取病毒蛋白，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离病毒外壳蛋白，把蛋白带转移到醋酸纤维素膜上，再进行抗原抗体反应，根据外壳蛋白分子量和吸附特异性抗血清显示特殊条带来判断病毒的存在。电印迹免疫分析与酶联免疫吸附试验相比具有明显的优点，可用于检测低浓度的植物病毒，灵敏度较高。但此方法不适用于大量样品的检测，且相对操作较为复杂[17]。

1.3 分子生物学方法

1.3.1 聚合酶链式反应 PCR技术将引物、待扩增DNA样品、dNTP和DNA聚合酶加入到PCR缓冲液中，经反复加热变性和退火延伸，最后利用琼脂糖凝胶电泳或核酸杂交技术进行植物病毒检测。Geri等利用PCR技术成功克隆出花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)，并进行转基因操作[18]；Osman等利用定量PCR技术检测出3种葡萄病毒，检测不同地区的48个品种得出，95.83% 的品种为多种病毒的复合感染，单一病毒感染的现象极少出现[19]；Feng等运用实时定量PCR技术检测出黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)，并建立了方程进行数据分析[20]。PCR用于植物病毒的鉴定与分类，灵敏度高、特异性强、快速简便，特别是当样品病毒含量低，免疫学方法难以检测出时，其检测效果较好。PCR技术受到引物设计的限制，对于未知基因，随机引物并不一定能够快速、特异、完整地复制出病毒基因，PCR技术在这种情况下检测植物病毒会有局限性。

1.3.2 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用引物与模板结合的荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR一般使用TaqMan®荧光探针。TaqMan®荧光探针的5′端带有荧光染料发出的荧光信号可被后端淬灭消失，荧光组分与淬灭组分分开产生荧光信号，荧光信号的强度与目标序列浓度或拷贝数成正比。在每个循环中，均会有分子被切割下来，荧光强度呈指数增长，如果在PCR过程中，底物序列不能同探针互补，则探针是游离的，没杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到。Zhang等利用实时荧光定量RT-PCR技术对玉米萎黄病毒(maize chlorotic mottle virus，MCMV)进行检测，玉米萎黄病毒的RT-PCR产物在40 fg/μL时仍能够出现清晰的条带，具有极高的灵敏度和特异性[21]；Eun等利用实时荧光定量RT-PCR技术检测出2种兰花属病毒(CymMV、ORSV)，且得到的2种兰花病毒在浓度为5 fg/μL时即可检测出病毒外壳蛋白基因的存在[22]。实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高，并且可以在1个反应管内完成，减少了污染，具实时性和准确性等特点。

1.3.3 RT-PCR、mRT-PCR、RT-qPCR 植物病毒中大多数是RNA病毒，RNA病毒则需先将RNA反转录成cDNA再进行PCR扩增，此方法称为RT-PCR。Silva等利用RT-PCR技术对山药花叶病毒(Yam mosaic virus，YMV)进行检测发现，RNA最小浓度为14 pg/μL时会出现非常明显的电泳条带[23]；Miglino等利用RT-PCR技术对病毒及大分子进行检测，如烟草脆裂病毒(TRV)、百合X病毒(LVX)、水仙斑点病毒(NMV)等，检测效果较好[24]；Trzmiel等利用实时 RT-PCR技术对土传小麦花叶病毒(Soil-borne wheat mosaic virus，SBWMV)进行检测与鉴定，克隆分析了SBWMV的基因序列及同源性[25]。

在此基础上又发展了用于植物病毒检测的多种方法，包括mRT-PCR和RT-qPCR。mRT-PCR为多重RT-PCR反应，即在同一RT-PCR反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段，达到快速、简便的目的。逆转录定量PCR反应(RT-qPCR)主要用于定量检测逆转录后cDNA的含量，RT-qPCR技术具备较高的灵敏度与特异性。Nam等已经成功利用此方法检测出了多种大蒜病毒[3-4]；袁青等利用mRT-PCR技术检测多种马铃薯病毒也相继获得成功[5-6]；Ali等利用多重RT-PCR检测兰花花叶病毒(CymMV)、兰花斑点病毒(OFV)、齿舌兰环斑病毒(ORSV)，且成功建立一步法多重RT-PCR反应体系应用于兰花病毒的检测[26]；Osman等利用RT-qPCR技术对橘树根枯病毒(citrus tristeza virus，CTV)、橘树鳞皮病毒(citrus psorosis virus，CPsV)、橘树叶斑病毒(Citrus leaf blotch virus，CLBV)进行检测，多重RT-PCR反应能够简化病毒检测步骤，提高检测效率[27]；de Francesco等对RT-qPCR和ELISA 2种技术进行了比较，结果表明，RT-qPCR 比酶联免疫吸附试验更灵敏，其相对的PCR检测浓度分别为103～104、105～106CFU/mL[28]；Zhang等利用差速离心法对RT-PCR技术进行改善，结果表明，改善后的方法增加了对马铃薯Y病毒检测的灵敏度[29]。这种方法在一些病毒浓度较低的植物病毒检测中起到了良好的作用，具备较高的灵敏度与特异性，这种方法对样品的要求较低，既可以是鲜活的植物材料，也可以是种子，可以检测出种质资源内部潜伏的一些病毒。

1.3.4 ddPCR、IP-RT-PCR、原位RT-PCR 微滴式数字PCR系统(ddPCR)是在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升(nL)级的微滴，每个微滴不含待检核酸靶分子或含有1个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行核酸荧光检测，有荧光信号为1，没有荧光信号为0，根据泊松分布原理(poisson distribution)及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。Koeppel等利用微滴式数字PCR技术结合实时PCR技术共同对4种转基因大豆MON87769、MON87708、MON87705、FG72和植物凝集素进行分析和鉴定，利用微滴式数字PCR技术检测植物病毒具有更高的准确性[30]；Lock等利用微滴式数字PCR技术对腺病毒进行研究，并与定量PCR进行比较，其灵敏度、特异性和性价比均比定量PCR高[31]；Hindson等将微滴式数字PCR技术与实时PCR比较得出，微滴式数字PCR具有更高的精确性和灵敏度，核酸的定量检测更为精确，是实时PCR的7倍，将为以后的癌症检测提供较好的手段[32]。

免疫沉淀反转录PCR技术(IP-RT-PCR)是免疫技术与PCR技术结合发展的一种植物病毒检测技术。Lima等利用免疫沉淀反转录PCR技术检测出木瓜致死黄病毒(papaya lethal yellowing virus，PLYV)、南瓜斑点病毒(squash mosaic virus，SQMV)、西葫芦黄斑病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)等3种病毒[33]。植物提取物稀释1 000倍时免疫沉淀反转录PCR技术能够检测出PLYV病毒的存在，而酶联免疫吸附技术则为100倍；对于SQMV病毒，IP-RT-PCR的检测限度为植物提取物稀释100 000倍，ELISA的检测限度为植物提取物稀释10倍；对于ZYMV病毒IP-RT-PCR的检测限度为植物提取物稀释10 000倍，ELISA的检测限度为植物提取物稀释100倍[33]。原位RT-PCR技术能够利用荧光探针定位植物病毒所在的植物组织部位，为植物病毒检测提供了新思路，杨洪一等利用间接原位RT-PCR技术检测出辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)主要位于栅栏组织，其次位于海绵组织，其他组织里很少或不存在[34]。

1.4 纳米生物传感器技术

用于检测植物病毒的生物传感器主要包括纳米生物传感器(nanomaterial sensor)、酶催化生物传感器(enzymatic biosensor)、基于DNA的压电生物传感器(DNA-based piezoelectric biosensor)、DNA分子信标生物传感器(DNA-based molecular beacon biosensor)、石英晶体抗体生物传感器(antibody-based quartz crystal biosensor)。生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，是由固定化的生物敏感材料作识别元件(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)、适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。

1.5 植物病毒检测技术的比较

植物病毒由于其在植物组织中浓度较低、分布不均匀、潜伏期无病毒表型等特征，给研究者对病毒的检测带来挑战，综合比较各种植物病毒的检测方法，由表1可知，形态学方法结合迅速发展的显微镜技术已经能够检测到微量的反应，分子生物学技术及生物微量传感器比免疫反应更灵敏，在利用和比较检测手段的同时也须要综合考虑时效性和性价比。

表1 当前植物病毒检测方法的比较

2 植物病毒的防治策略

2.1 农业措施

在明确病毒病害的发生规律、传毒介质及与气候、耕作制度等关系的基础上，消除病毒病的传染源，对农作物进行合理的轮作、间作、倒茬等，适当地进行施肥、灌溉、合理密植均可以改善植物的生长状态，提高它对病毒的抵抗力。Blanc等利用农业技术防治蚜虫传播植物病毒，对植物组织及蚜虫传播途径进行了细致的分析研究[46]；Bosque-Pérez等利用蚜虫传播植物病毒途径，分析研究了小麦黄矮病毒和马铃薯卷叶病毒的危害情况，管理好田间植物和土壤、切断病毒传播途径、培育壮苗及拔除早期病株等可在一定程度上减轻病毒病的危害程度[47]。

2.2 抗病育种

2.2.1 茎尖脱毒繁育无病毒苗木 病毒侵染植物后可进入植物细胞，在迅速分裂的细胞中，其分裂速度比病毒DNA复制速度快，因此，采用旺盛分裂的茎尖分生组织进行离体培养就可以获得脱毒植物。高山林等应用茎尖组织培养技术成功培养出大蒜幼苗，最适愈伤组织诱导激素配比为MS+0.2 mg/L 苄氨基嘌呤(BA)+0.5 mg/L 萘乙酸(NAA)，最适芽诱导激素配比为MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA[48]；Resende等利用体外微体快繁技术，成功培育出凤梨科植物的幼苗[49]；TakIn等利用茎尖组织培养技术成功脱除大蒜OYDV和LYSV 2种病毒，培育出无病毒植株幼苗，最适植物激素配比为MS+2 mg/L BA+0.5 mg/L IBA[50]；刘文萍等应用茎尖脱毒组织培养技术成功脱毒大蒜病毒，选取附带1个叶原基的茎尖分生组织，最适激素配比为MS+0.5 mg/L 激动素(KT)+0.5 mg/L NAA[51]。

利用茎尖分生组织培养技术已培育出无毒苹果、马铃薯、甘薯、大蒜、草毒和菊花等一大批无毒苗木。这些无毒苗在生产上的应用已经取得了明显的经济和社会效益，但缺点是成本高、工作量大，且由于病毒的田间再次侵染，维持无毒的有效期不长，2～3年后产量又会严重下降。

2.2.2 植物病毒基因工程 研究者已运用各种基因工程策略在多种植物上得到不同程度的抗病毒能力。国内有转基因抗病毒烟草、番茄、甜椒等产品已获准商业化应用，培育、推广应用抗病毒品种是最经济、最有效的防治措施之一。Yoon等利用转基因技术使大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus，BYDV)、谷物黄矮病毒(cereal yellow dwarf virus，CYDV)在植物中不表现出病毒症状，可提高作物的产量，转染其他作物则表现出病毒症状[52]；Chung等利用转基因技术成功构建出3种马铃薯病毒(PVA、PVY、PLRV)的无症状植株，植株长势良好，检测含3种病毒，但无病毒表型出现，提高了作物的产量[53]；侯文胜等构建了大豆的转基因植物，提高了作物的产量[54]；谢龙旭等成功构建了转基因烟草，不表现出烟草花叶病毒侵染的症状[55]；孙越等利用转基因技术获得了兼抗虫、抗除草剂、抗干旱的转基因玉米，大幅度提高了玉米的产量[56]。

研究者对转基因植物及其分泌物对环境的影响一直持有争议，赖欣等应用转基因技术获得了转基因大豆，并研究了分泌物对大豆根部细菌群落的影响，结果显示，其分泌物对固氮细菌没有影响[57]；王丽娟等对转基因大豆和正常大豆进行比较分析，转基因大豆根系微生物利用单一碳源比非转基因大豆多，整体利用率无差异[58]；Chatthai等应用转基因技术和分子生物学分析出转基因作物松科植物在基因上游表现出较强的保守性，成功完成转基因植株的培育[59]；Silva等对4种转基因棉花进行分析，其抗虫、抗病毒作用明显，但转基因只在1代起作用，传代的作物不表现出转基因的抗虫抗病性[60]；Li等利用2个转基因棉花进行研究，发现其与非转基因棉花比较根系会分泌更多的糖和氨基酸，根系分泌物可以促进真菌孢子的萌发和菌丝的生长，表明转基因植物不安全[61]；Wu等对转Bt蛋白基因的棉花进行研究，结果表明它与正常的棉花无差异，表明转基因植株是安全的，转基因植物的安全性还须进一步分析研究[62]。

2.3 化学药剂防治

由于病毒寄生于寄主细胞内，与寄主细胞共存，难以找到对病毒有杀伤作用又对寄主无损害的选择性化学药物。为了开发出比较理想的抗植物病毒药物，研究人员从天然抗病毒植物药剂和化学合成抗病毒药剂2个方面开展了研究。目前正在使用的化学药剂主要有蛋白质类、生物碱类、黄酮类、有机酸、碱基衍生物、多聚糖以及植物激素等。Prabahar等发现，多种化学物质可以抑制烟草花叶病毒，异丙肾上腺素、核黄素、阿托品、阿苯达唑、新霉素、氨苄青霉素等均能够抑制茄科植物感染的烟草花叶病毒(TMV)[63]；李红霞研究了香菇多糖、中草药提取物、五倍子提取物对烟草花叶病毒的抑制作用[64]；陈启建研究了黄酮苷、大蒜精油等对烟草花叶病毒的抑制作用[65]；采用合理的复配制剂、适时用药是充分发挥化学防治作用的重要因素。

2.4 弱毒疫苗接种技术

弱毒疫苗接种技术是利用植物经常感染或易于感染的病毒对已经接种处理过的植株再次感染这一植物病毒时，植株会对其产生免疫，同时弱毒不会对植株产生强烈的影响，采用弱毒疫苗接种技术防治蔬菜、果树病毒病已经获得了较大的研究进展。覃秉益等利用弱毒疫苗技术对烟草花叶病毒番茄株弱毒疫苗N14的安全性进行测定，将其接种到17种不同科的植物，每种4株，其中除矮牵牛表现轻微的花叶症状外，其他植物均无症状，弱毒疫苗已连续传代100多次，毒力无明显变化[66]；易荣大介绍了弱毒疫苗接种技术的过程及注意事项，利用弱毒疫苗接种的番茄花叶病毒使番茄产量大幅上升，具有减少农药用量、不污染环境、不影响生态平衡等优点[67]。

2.5 植物病毒防治策略的比较分析

随着对植物病毒传播途径的深入了解，加快抗病毒药物的研制是目前最直接有效的防治手段，各种转基因抗病植物相继建成，并应用到农业生产中。但是真正经济、实惠、便于农民接受的防治病毒病的措施仍是推广抗病或耐病的优良品种，因此，选育抗病毒病或耐病毒病的作物品种意义重大。表2比较分析了现阶段防治植物病毒病的策略。

表2 植物病毒病防治策略的比较分析

3 展望

PCR技术凭借着其操作简单、结果可信、实用性广等优点仍是应用最广泛的检测手法之一，基于PCR技术的RT-PCR、mRT-PCR、ddPCR、IP-RT-PCR技术也日趋成熟。PCR技术与酶联免疫吸附技术结合共同应用于植物病毒检测可以提高检测的灵敏度和特异性，结合多种病毒检测技术开发新产品具有较好的前景。Charoenvilaisiri等利用RT-PCR技术与酶联免疫吸附技术结合开发出新的RT-PCR-ELISA技术用于检测辣椒黄矮病毒(CaCV)、甜瓜斑点病毒(MYSV)、番茄致死环斑病毒(TNRV)和西瓜银色斑点病毒(WSMoV)等4种病毒，检测效果好、特异性强[12]。将纳米技术、免疫技术、荧光技术、分子杂交技术等共同应用于生物传感器将是发展检测技术的趋势，使检测技术更趋向于实时性和实效性。原位RT-PCR技术结合电子显微镜，能够高分辨率地观察到探针显示的植物病毒在组织中的位置，为病毒病的检测分析和防治提供了较好的理论基础。

对植物病毒病的防治，应本着易于推广、灵敏度高、特异性强、准确率高的目的开展机械化选苗育种，统一栽培管理，从源头去除植物病毒，切断植物病毒病的传播途径等。现阶段对植物病毒侵染植物体的研究日益深入，病毒感染植物的机制不断被人们发现，已经开发出一些能够抑制或完全脱除多种植物病毒的化学药物，后续研究者须要更加深入了解病毒在植物体中侵染繁殖的机制，开发出相应的药物用于预防、治疗植物病毒病，减轻病毒病对农业生产造成的损失。

[1]Keinan A，Clark A G. Recent explosive human population growth has resulted in an excess of rare genetic variants[J]. Science，2012，336(6082)：740-743.

[2]Godfray H C，Beddington J R，Crute I R，et al. Food security：the challenge of feeding 9 billion people[J]. Science，2010，327(5967)：812-818.

[3]Nam M，Lee Y H，Park C Y，et al. Development of multiplex RT-PCR for simultaneous detection of garlic viruses and the incidence of garlic viral disease in garlic genetic resources[J]. The Plant Pathology Journal，2015，31(1)：90-96.

[4]Hu X X，Lei Y，Wang P，et al. Development of a multiplex reverse transcription-PCR assay for simultaneous detection of garlic viruses[J]. Journal of Integrative Agriculture，2015，14(5)：900-908.

[5]袁 青，殷幼平，王中康. 二重RT-PCR快速检测马铃薯病毒的方法[J]. 植物检疫，2005，19(3)：135-138.

[6]董代幸，张祥林，罗 明，等. 马铃薯病毒一步法多重RT-PCR检测技术的构建[J]. 微生物学通报，2011，38(1)：131-137.

[7]Shapiro O H，Kramarsky-Winter E，Gavish A R，et al. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals[J]. Nature Communications，2016，7：10860.

[8]de Souza T V，Thiesen J F，Lando A P，et al. Morpho-histodifferentiation ofBillbergiaThunb. (Bromeliaceae) nodular cultures[J]. Protoplasma，2017，254(1)：435-443.

[9]肖 英，程秉铨. 电子显微镜在植物病毒研究中的应用[J]. 新疆农业科学，1995(4)：168-170.

[10]Henderson G P，Gan L，Jensen G J. 3-Dultrastructure ofO.tauri：electron cryotomography of an entire eukaryotic cell[J]. PLoS One，2007，2(8)：e749.

[11]Li N，Chen Z，Liu Y，et al. Development of monoclonal antibodies and serological assays specific for Barley yellow dwarf virus GAV strain[J]. Virology Journal，2015，12(1)：136.

[12]Charoenvilaisiri S，Seepiban C，Bhunchoth A，et al. Development of a multiplex RT-PCR-ELISA to identify four distinct species of tospovirus[J]. Journal of Virological Methods，2014，202(7)：54-63.

[13]Zang F H，Konstantinos G，Fan X Z，et al. Real-time monitoring of macromolecular biosensing probe selfassembly and on-chip ELISA using impedimetric microsensors[J]. Biosensors and Bioelectronics，2016，81：401-407.

[14]Wullings B A，Van Beuningen A R，Janse J D，et al. Detection of ralstonia solanacearum，which causes brown rot of potato，by fluorescent in situ hybridization with 23S rRNA-targeted probes[J]. Applied and Environmental Microbiology，1998，64(11)：4546-4554.

[15]Shargil D，Zemach H，Belausov E，et al. Development of a fluorescent in situ hybridization(FISH) technique for visualizing CGMMV in plant tissues[J]. Journal of Virological Methods，2015，223(2)：55-60.

[16]Kliot A，Kontsedalov S，Lebedev G，et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues[J]. Journal of Visualized Experiments，2014(84)：e51030.

[17]庞 博. 马铃薯四种病毒多重PCR检测体系的建立[D]. 兰州：甘肃农业大学，2014.

[18]Geri C，Cecchini E，Giannakou M E，et al. Altered patterns of gene expression inArabidopsiselicited by cauliflower mosaic virus (CaMV) infection and by aCaMVgeneVItransgene[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，1999，12(5)：377-384.

[19]Osman F，Hodzic E，Omanska-Klusek A，et al. Development and validation of a multiplex quantitative PCR assay for the rapid detection of Grapevine virus A，B and D[J]. Journal of Virological Methods，2013，194(1/2)：138-145.

[20]Feng J，Zeng R，Chen J. Accurate and efficient data processing for quantitative real-time PCR using a tripartite plant virus as a model[J]. BioTechniques，2008，44(7)：901-912.

[21]Zhang Y，Zhao W，Li M，et al. Real-timeTaqMan RT-PCR for detection of maize chlorotic mottle virus in maize seeds[J]. Journal of Virological Methods，2011，171(1)：292-294.

[22]Eun A J，Seoh M L，Wong S M . Simultaneous quantitation of two orchid viruses by theTaqMan®real-time RT-PCR[J]. Journal of Virological Methods，2000，87(1/2)：151-160.

[23]Silva G，Bömer M，Nkere C，et al. Rapid and specific detection of Yam Mosaic virus by reverse-transcription recombinase polymerase amplification[J]. Journal of Virological Methods，2015，222：138-144.

[24]Miglino R，Jodlowska A，Pappu H R，et al. A semi-automated and highly sensitive streptavidin magnetic capture-hybridization RT-PCR assay：application to genus-wide or species-specific detection of several viruses of ornamental bulb crops[J]. Journal of Virological Methods，2007，146(1/2)：155-164.

[25]Trzmiel K，Lewandowska M. Detection and discrimination of European isolates of soil-borne wheat Mosaic virus using immunocapture real-time reverse transcription-polymerase chain reaction[J]. Journal of Virological Methods，2015，225：55-58.

[26]Ali R N，Dann A L，Cross P A，et al. Multiplex RT-PCR detection of three common viruses infecting orchids[J]. Archives of Virology，2014，159(11)：3095-3099.

[27]Osman F，Hodzic E，Kwon S J，et al. Development and validation of a multiplex reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for the rapid detection of Citrus tristeza virus，Citrus psorosis virus，and Citrus leaf blotch virus[J]. Journal of Virological Methods，2015，220(3)：64-75.

[28]de Francesco A，Costa N，Plata M I，et al. Improved detection of citrus psorosis virus and coat protein-derived transgenes in citrus plants：comparison between RT-qPCR and TAS-ELISA[J]. Journal of Phytopathology，2015，163(11/12)：915-925.

[29]Zhang J H，Nie X Z，Boquel S，et al. Increased sensitivity of RT-PCR for Potato virus Y detection using RNA isolated by a procedure with differential centrifugation[J]. Journal of Virological Methods，2015，225：49-54.

[30]Koeppel R，Bucher T，Frei A，et al. Droplet digital PCR versus multiplex real-time PCR method for the detection and quantification of DNA from the four transgenic soy traits MON87769，MON87708，MON87705 and FG72，and lectin[J]. European Food Research and Technology，2015，241(4)：521-527.

[31]Lock M，Alvira M R，Chen S J，et al. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR[J]. Human Gene Therapy Methods，2014，25(2)：115-125.

[32]Hindson C M，Chevillet J R，Briggs H A，et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR[J]. Nature Methods，2013，10(10)：1003-1005.

[33]Lima J A A，Nascimento A K Q，Radaelli P，et al. A technique combining immunoprecipitation and RT-PCR for RNA plant virus detection[J]. Journal of Phytopathology，2014，162(7/8)：426-433.

[34]杨洪一，郭世辉，李丽丽. 间接原位RT-PCR法检测辣椒叶组织中辣椒轻斑驳病毒的分布[J]. 园艺学报，2015，34(3)：489-495.

[35]Kim J H，Chung H H，Jeong M S，et al. One-step detection of circulating tumor cells in ovarian cancer using enhanced fluorescent silica nanoparticles.[J]. International Journal of Nanomedicine，2013，8(4)：2247-2257.

[36]Pérez-López B，Merkoçi A. Nanoparticles for the development of improved (bio)sensing systems[J]. International Journal of Nanomedicine，2011，399(4)：1577-1590.

[37]Algar W R，Krull U J. Quantum dots as donors in fluorescence resonance energy transfer for the bioanalysis of nucleic acids，proteins，and other biological molecules[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2008，391(5)：1609-1618.

[38]Frasco M F，Chaniotakis N. Semiconductor quantum dots in chemical sensors and biosensors[J]. Sensors，2009，9(9)：7266-7286.

[39]Song Y，Luo Y N，Zhu C Z，et al. Recent advances in electrochemical biosensors based on graphene two-dimensional nanomaterials[J]. Biosensors and Bioelectronics，2016，76：195-212.

[40]Pumera M. Graphene in biosensing[J]. Materials Today，2011，14(7)：308-315.

[41]Adriaenssens E M，Van Vaerenbergh J，Vandenheuvel D，et al. T4-related bacteriophage LIMEstone isolates for the control of soft rot on potato caused by ‘Dickeya solani’[J]. PLoS One，2012，7(3)：e33227.

[42]Schofield D，Bull C T，Rubio I，et al. “Light-tagged” bacteriophage as a diagnostic tool for the detection of phytopathogens[J]. Bioengineered，2013，4(1)：50-54.

[43]Fujiwara A，Fujisawa M，Hamasaki R，et al. Biocontrol of ralstonia solanacearum by treatment with lytic bacteriophages[J]. Applied and Environmental Microbiology，2011，77(12)：4155-4162.

[44]Eun A J C，Huang L Q，Chew F T，et al. Detection of two orchid viruses using quartz crystal microbalance (QCM) immunosensors[J]. Journal of Virological Methods，2002，99：71-79.

[45]Eun A，Huang L，Chew F，et al. Detection of two orchid viruses using quartz crystal microbalance-based DNA biosensors[J]. Phytopathology，2002，92(6)：654-658.

[46]Blanc S，Uzest M，Drucker M. New research horizons in vector-transmission of plant viruses[J]. Current Opinion in Microbiology，2011，14(4)：483-491.

[47]Bosque-Pérez N A，Eigenbrode S D. The influence of virus-induced changes in plants on aphid vectors：insights from luteovirus pathosystems[J]. Virus Research，2011，159(2)：201-205.

[48]高山林，金雍安，蔡朝晖，等. 大蒜分生组织培养脱病毒和快速繁殖技术[J]. 植物资源与环境学报，2000，9(3)：15-18.

[49]Resende C F，Braga V F，Pereira P F，et al. Proline levels，oxidative metabolism and photosynthetic pigments duringinvitrogrowth and acclimatization ofPitcairniaencholirioidesL.B. Sm. (Bromeliaceae)[J]. Brazilian Journal of Biology，2016，76(1)：218-227.

[51]刘文萍，于世选，韩玉芹，等. 应用生物技术脱除大蒜病毒的研究[J]. 生物技术，1992，2(2)：27-29.

[52]Yoon J Y，Choi S K，Palukaitis P，et al. Agrobacterium-mediated infection of whole plants by yellow dwarf viruses[J]. Virus Research，2011，160(1/2)：428-434.

[53]Chung B N，Yoon J Y，Palukaitis P. Engineered resistance in potato against potato leafroll virus，potato virus A and potato virus Y[J]. Virus Genes，2013，47(1)：86-92.

[54]侯文胜，林抗雪，陈 普，等. 大豆规模化转基因技术体系的构建及其应用[J]. 中国农业科学，2014，47(21)：4198-4210.

[55]谢龙旭，徐培林，聂燕芳，等. 抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析[J]. 生物工程学报，2003，19(5)：545-550.

[56]孙 越，刘秀霞，李丽莉，等. 兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定[J]. 中国农业科学，2015，48(2)：215-228.

[57]赖 欣，张永生，赵 帅，等. 转基因大豆对根际固氮细菌群落多样性的影响[J]. 生态学杂志，2010，29(9)：1736-1742.

[58]王丽娟，李 刚，赵建宁，等. 转基因大豆对根际土壤微生物群落功能多样性的影响[J]. 农业环境科学学报，2013，32(2)：290-298.

[59]Chatthai M，Forward B S，Yevtushenko D，et al. 2S storage protein gene of douglas-fir：characterization and activity of promoter in transgenic tobacco seeds[J]. Plant Physiology & Biochemistry，2004，42(5)：417-423.

[60]Silva C R，Monnerat R，Lima L M，et al. Stable integration and expression of acry1Iagene conferring resistance to fall armyworm and boll weevil in cotton plants[J]. Pest Management Science，2016，72(8)：1549-1557.

[61]Li X G，Liu B，Heia S，et al. The effect of root exudates from two transgenic insect-resistant cotton lines on the growth ofFusariumoxysporum[J]. Transgenic Research，2009，18(5)：757-767.

[62]Wu H S，Shi X，Li J，et al. Effects of root exudates of bivalent transgenic cotton (Bt+CpTI) plants on antioxidant proteins and growth of conventional cotton (Xinluhan 33)[J]. Journal of Environmental Biology，2016，37(1)：13-19.

[63]Prabahar A，Swaminathan S，Loganathan A，et al. Identification of novel inhibitors for tobacco mosaic virus infection in solanaceae plants[J]. Advances in Bioinformatics，2015(14)：198-214.

[64]李红霞. 几种抗病毒药剂对烟草花叶病毒的抑制作用及相关机理研究[D]. 保定：河北农业大学，2010.

[65]陈启建. 抗烟草花叶病毒植物源活性物质的筛选及其作用机制[D]. 福州：福建农林大学，2003.

[66]覃秉益，张秀华，田 波. 植物病毒弱株系及其应用 Ⅲ. 烟花叶病毒番茄株弱毒疫苗N14的安全性测定[J]. 微生物学报，1987，27(1)：23-29.

[67]易荣大. 介绍一种预防植物病毒病的新技术——弱毒疫苗[J]. 湖北农业科学，1987(12)：39.