濒危植物蒙古扁桃ISSR反应体系优化

丁海麦， 白 羽， 石松利

(1.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古包头 014040； 2.包头医学院药学院，内蒙古包头 014040)

蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)为蔷薇科(Rosaceae)桃属(Amygdalus)植物，是亚洲中部戈壁荒漠区特有的旱生落叶灌木、国家三级濒危保护植物[1]。蒙古扁桃是荒漠区重要牧草，其叶、嫩枝、花及果实均为家畜喜食，在植被稀疏干旱少雨荒漠区，草原牧民称之为“救命草”[2]。同时，蒙古扁桃为传统的中药材，以种仁入药，性苦，味平，主治干咳、咽喉干燥、支气管炎及阴虚便秘，还可制成止痛剂和镇静剂，对糖尿病、高血压、神经衰弱、肺炎等有一定疗效[3-4]。由此可见，蒙古扁桃具有广阔的开发价值。蒙古扁桃的研究目前主要集中在有效成分提取分离、鉴定分析技术、药理性等方面，且均取得一定成果，但对于蒙古扁桃资源的各地品种遗传多样性水平和遗传结构研究仍不多。

简单重复序列区间(inter simplese quencerepeat，简称ISSR)是在微卫星技术上发展起来的分子标记技术，是一种简单高效的遗传标记方法，具有多态性高、产物特异性强等特点[5]，该技术已广泛应用于作物、花卉、中药材遗传多样性和亲缘关系研究中。ISSR原理是利用锚定的SSR-DNA作为引物进行PCR扩增，进而检测相邻SSR之间基因组DNA序列的差异。由于ISSR分子标记技术是基于PCR技术开发的，影响扩增结果的因素包括引物、模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶活性等，对于不同的反应体系和扩增程序，ISSR的结果是不同的[6]。因此，为确保ISSR-PCR扩增结果的稳定和准确，需对此扩增反应体系进行优化。本研究主要针对ISSR反应体系的5个因素，在4个水平上对内蒙古包头赵长城遗址濒危植物蒙古扁桃进行ISSR-PCR体系优化，以期建立适合蒙古扁桃ISSR-PCR的最佳反应体系，为今后利用ISSR标记技术对蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所取材料为蒙古扁桃的嫩叶，采集于内蒙古包头市赵长城遗址。

1.2 试剂和仪器

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、10×PCR Buffer(Mg2+free)、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs、ISSR引物840(5′-GAGAGAGAGAGAGAYT-3′)等，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR仪，由Biometra公司生产；微量紫外可见分光光度计，NanoDrop；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 总DNA的提取 采用改进的CTAB法提取蒙古扁桃叶基因组总DNA，采用微量紫外分光光度计及0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度。

1.3.2 ISSR-PCR扩增反应程序 采用25 μL PCR反应体系，基本扩增程序如下：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，47 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35次循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存，电泳检测。

1.3.3 ISSR-PCR反应体系的优化 在普通PCR反应体系基础上采用L16(45)正交设计PCR反应，对Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶活性、dNTPs浓度、引物835浓度和DNA模板质量进行5因素4水平筛选(表1)，最终确定最佳反应体系。在总体积为25 μL的体系中，除表1中各主要因素之外，每管中加入10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL，补加ddH2O直至总体积为25 μL。其模板为赵长城遗址蒙古扁桃嫩叶基因组DNA。在PCR仪上进行扩增反应，扩增产物选用1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后将胶体放入凝胶成像系统中观察并拍照保存。试验结果参照贺石林的统计方法[7]，对ISSR-PCR扩增结果依据电泳条带的强弱、多少及背景清晰程度进行打分，效果最佳的得16分，最差的得1分，效果居中的得 2～15分。

表1 PCR反应的L16(45)正交试验设计

1.3.4 UBC840最佳退火温度 依据试验结果，将优化的反应体系在梯度PCR模式下设定退火温度为41～53 ℃，依据PCR产物电泳结果，确定最优的退火温度。

1.3.5 最佳反应体系验证 选择已筛选的ISSR引物UBC840和7个不同居群蒙古扁桃不同的样品，检测优化的ISSR-RCR体系及扩增程序的稳定性。

2 结果与分析

2.1 DNA检测

用1%琼脂糖凝胶于80 V电泳50 min，检测所提取DNA的完整性。结果如图1所示，可见提取的DNA样品较纯，无降解。所提取的蒙古扁桃叶DNA样品用微量紫外可见分光光度计测得D260 nm/D280 nm值在1.80～1.85之间，符合PCR的要求。将DNA浓度稀释至50 ng/μL备用。

2.2 ISSR-PCR反应体系的正交设计直观分析

参照贺石林的统计方法[7]，对16个组合正交试验结果(图1)进行分析，根据正交试验结果打分，效果最佳的得16分，最差的得1分，各体系得分依次为7、7、5、6、15、14、2、14、12、14、8、13、16、15、11、1分。Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量、Taq酶活性这5个因素正交试验得分的多重比较结果(极差)分别为5.50、6.25、4.25、2.50、6.50，可见在本试验设置的因素水平范围内，5个因子间各水平具有不同显著性，其影响顺序依次为Taq酶活性>引物浓度>Mg2+浓度>dNTPs浓度>模板DNA用量。

2.3 同一因素内不同水平对PCR结果的影响

2.3.1 Mg2+浓度对PCR结果的影响 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有明显影响。由表2可知，本试验中Mg2+浓度对结果的影响较大，在1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 4个Mg2+浓度处理之间得分均值差异明显，且随着Mg2+浓度的增加，得分均值在一定范围内逐渐增大，高浓度的Mg2+降低了Taq酶活性，使反应的产物减少。因此，本试验以2.0 mmol/L为最佳Mg2+浓度。

2.3.2Taq酶浓度对PCR结果的影响Taq酶是Mg2+依赖性酶，Mg2+浓度可影响酶的活性和专一性。由表3、图1可知，本试验中Taq酶浓度对结果的影响最大，不同浓度Taq酶的得分均值明显不同。综合考虑，本试验以2.0 U为最佳Taq酶用量。

表2 Mg2+浓度与得分均值的关系

2.3.3 引物浓度对PCR结果的影响 引物是PCR反应体系

表3 Taq酶活性与得分均值的关系

的关键成分，PCR产物的特异性由引物与模板DNA的互补程度决定；引物浓度偏高可引起非特异性扩增，同时也会增加引物之间形成二聚体的机会。由表4可知，本试验范围内的不同引物浓度的得分均值存在明显差异，得分均值在引物浓度为0.40～0.80 μmol/L范围内随着引物浓度的提高而逐渐增大。综合考虑，本试验以0.80 μmol/L为最佳引物浓度。

表4 引物浓度与得分均值的关系

2.4 引物840最佳退火温度选择

梯度PCR结果表明，温度低时特异性较差，产生条带相对较多，同时又缺失小片段；退火温度较高时，引物与模板的结合性差，又造成大片段的缺失，导致PCR扩增产物谱带数减少，同时亮度减弱。因此UBC840的最佳退火温度范围为第4～5泳道，最终选择49 ℃(图2)。

2.5 ISSR-PCR最优体系的验证

以UBC840为引物，利用正交设计优化的蒙古扁桃 ISSR-PCR反应体系，对7份不同种质材料进行PCR扩增，得到的PCR条带数目多且清晰，能区分7份蒙古扁桃种质(图3)。由结果可知，优化的蒙古扁桃ISSR-PCR反应体系稳定可靠，可应用于蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定。

3 讨论

ISSR分子标记是从SSR发展而来的，是一种微卫星标记技术[8-9]，一般每个引物可以扩增出6条左右的条带，为保证ISSR-PCR试验结果的重复性、稳定性，要充分考虑反应体系、扩增程序及不同物种的影响[10]。

本研究表明，在蒙古扁桃ISSR-PCR反应体系中，Taq酶、引物和Mg2+浓度是影响ISSR-PCR反应结果很重要的3个因素。Taq酶的浓度关系到PCR扩增反应的成败，酶浓度过低时扩增速率低，条带少且条带模糊，甚至无扩增条带[11]，酶浓度过高会产生非特异条带。引物浓度对PCR扩增产物的特异性有明显影响，浓度较高容易产生非特异条带，浓度较低则不能扩增[12]。Mg2+作为Taq酶的辅助因子，其浓度不但影响Taq酶活性，而且可与反应体系中的dNTPs相结合，对PCR扩增产物的特异性和产量均有显著影响，其浓度过高时，多余的Mg2+鳌合dNTPs，使dNTPs消耗殆尽，扩增产物呈现单链化，非特异性条带产量增加；Mg2+浓度过低时，则由于dNTPs鳌合Mg2+降低Taq酶活性，使扩增产物减少。本研究优化后的 25 μL 反应体系如下：Taq酶活性2.0 U，引物浓度 0.80 μmol/L，Mg2+浓度2.0 mmol/L，dNTPs浓度 0.25 mmol/L，模板DNA质量50 ng。本试验优化的ISSR-PCR体系为进一步利用ISSR技术对蒙古扁桃资源遗传多样性进行评价和种质资源鉴定等奠定了基础。

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