墨兰绿墨素与大花蕙兰世界和平杂交种组培快繁技术

宋 莲， 王玉英， 张宇欢， 陈淑英， 李枝林，2

(1.云南农业大学园林园艺学院花卉研究所，云南昆明 650201； 2.生物多样性与云南特色农业协同创新中心，云南昆明 650201)

墨兰(Cymbidiumsinense)别称报岁兰、入岁兰，分布于中国福建、台湾、广东、广西、云南、贵州、四川等省(区)，花期为9月至次年3月，根长而粗壮，假鳞茎椭圆形，叶片剑形，花茎直立，高出叶面，花香浓郁，抗性强[1]。大花蕙兰(C.hybridium)别称西姆比兰、东亚兰，花期10月至次年4月，是兰属中一些热带附生种的杂种，株型高大，花大色艳，花期长、无香味，适应性强，既可盆栽，又可作切花。杂交育种是兰花育种最传统、最有效的方法，通过墨兰×大花蕙兰杂交获得F1代植株，可有望选育出具有国兰“香”、洋兰“艳”的兰花新品系。但是，兰花种子相对较小，内含发育不完全球形胚，在自然条件下很难萌发，而采用离体胚培养[2]可解决这一难题。

目前，在墨兰、大花蕙兰、线艺兰、野生碧玉兰、墨兰金华山×春兰宋梅、春兰紫萼×大花蕙兰日本绿等兰属植物上有相关组培技术的报道[3-8]，但对墨兰绿墨素与大花蕙兰世界和平的F1后代组织培养技术研究尚未见报道。因此，本研究以墨兰绿墨素与大花蕙兰世界和平杂交种原球茎为试验材料，探索其增殖分化、不定芽增殖、生根的最佳培养基配方，以期为其新种质的创制和规模化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

墨兰绿墨素(♀)与大花蕙兰世界和平(♂)杂交种原球茎，由云南农业大学花卉研究所自主培育。试验试剂均为市购。

1.2 方法

1.2.1 原球茎的增殖分化 选取大小相同、嫩绿且长势良好的杂交种原球茎，剔除培养基、幼根和芽，接种于以1/2MS培养基为基本培养基，添加不同浓度及配比的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)(表1)及琼脂6.5 g/L、蔗糖 30 g/L、香蕉80 g/L、活性炭0.5 g/L，pH值为5.8的培养基上进行增殖培养，培养条件为温度(23±2)℃，光照度 1 800～2 500 lx。每处理45个原球茎，重复3次。培养45、60 d后分别统计增殖率、出芽数。

1.2.2 不定芽的增殖 选取生长健壮、长势一致的不定芽，接种于以1/2MS培养基为基本培养基，添加不同激素配比(表2)及琼脂6.5 g/L、蔗糖30 g/L、香蕉80 g/L、活性炭 0.5 g/L，pH值为5.8的培养基上进行增殖培养，培养条件为温度(23±2)℃，光照度 1 800～2 500 lx。每处理40个不定芽，重复3次。培养60 d后统计不定芽的增殖率。

1.2.3 生根培养 将株高为3～5 cm的无根苗接种于以 1/2MS 培养基为基本培养基的不同生根培养基(表3、表4)中进行培养，培养条件为温度(23±2)℃，光照度1 800～2 500 lx。每瓶5株，每处理10瓶，重复3次。接种45 d后观察生根情况。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2003软件对数据进行整理，采用SPSS 20.0软件进行方差分析，采用最小显著性差异法(LSD法)对试验数据进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对杂交兰原球茎增殖分化的影响

由表1可见，含不同激素的培养基对墨兰、大花蕙兰杂交种原球茎增殖分化效果差异明显；含6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基对杂交兰原球茎的增殖相对最好，增殖率为317.77%，显著高于其他培养基(P<0.05)，说明杂交兰原球茎增殖的最佳配方为1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖3%+琼脂6.5 g/L+香蕉80 g/L+活性炭0.5 g/L；接种后60 d，部分原球茎分化出幼芽，含6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L的培养基原球茎出芽率相对最高，为54.96%，显著高于其他培养基处理(P<0.05)，说明原球茎分化效果最优的培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖3%+琼脂6.5 g/L+香蕉80 g/L+活性炭0.5 g/L。

表1 不同培养基对墨兰×大花蕙兰原球茎增殖分化的影响

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 不同6-BA浓度对杂交兰不定芽增殖的影响

由表2可知，当NAA浓度为0.3 mg/L时，含不同浓度 6-BA 的培养基对墨兰、大花蕙兰杂交种不定芽的增殖有明显差异，含6-BA 2.0 mg/L的培养基增殖率相对最高，为227.5%，显著高于其他培养基处理(P<0.05)；6种培养基配方中，6-BA浓度在0.5～2.0 mg/L时，随6-BA浓度的增加，不定芽增殖率升高，当6-BA浓度大于2.0 mg/L时，不定芽的增殖受到抑制；1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L+香蕉80 g/L+活性炭0.5 g/L为杂交兰不定芽增殖的最佳配方。

表2 不同6-BA浓度对杂交兰不定芽增殖的影响

2.3 不同培养基对杂交兰生根的影响

2.3.1 不同NAA浓度对杂交兰生根的影响 由表3可见，5组培养基配方均能诱导墨兰绿墨素、大花蕙兰世界和平杂交组培苗的生根，且NAA对生根率的影响差异明显；含NAA 0.5 mg/L 的培养基杂交兰生根率相对最高，为81%，分别比含NAA 1.0、1.5、2.5 mg/L培养基培养的显著高30.65%、24.62%、32.79%(P<0.05)，且根数多而粗，植株生长健壮。

表3 不同NAA浓度对杂交兰生根的影响

注：-代表不生长；+代表长势一般；++代表长势良好；+++代表长势健壮。下同。

2.3.2 不同活性炭用量对杂交兰生根的影响 由表4可知，活性炭对杂交兰生根的影响差异显著(P<0.05)；活性炭用量为1.0 g/L时的生根率相对最高，为81%，且苗生根情况和生长情况最佳，分别比活性炭用量为0.5、0 g/L的高 24.62%、47.27%。因此，生根效果相对最好的培养基为 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L+香蕉80 g/L+活性炭1.0 g/L。

3 结论与讨论

在兰花组织培养中，最常用的培养基为MS、VW、KC、H、RM、White及其改良型，应用时可根据不同品种和类原球茎的形成、增殖、分化及壮苗等不同培养阶段加以修改[9]。低盐培养基有利于兰花的生长，朱根发等认为，1/2MS培养基有利于大花蕙兰的快速繁殖[10]；丁雪珍等认为，最适于墨兰根状茎增殖的基本培养基为1/2MS[11]；罗虹等在研究墨兰的组织培养和快速繁殖中也使用1/2MS培养基[12]。

表4 不同活性炭用量对杂交兰生根的影响

植物激素是植物新陈代谢中产生的天然复合物，植物激素的种类和浓度是影响兰花组织培养的重要因素之一，很小的量就会影响植物细胞的分化、分裂、发育、形态建成、开花和结实等[13-14]。细胞分裂素的作用在于刺激细胞分裂、诱导芽的分化、促使叶片扩大和茎长高、打破顶端优势、促进丛生芽的形成和增殖、抑制根的生长[15]，而目前6-BA是兰花组织培养中最常用的细胞分裂素之一。生长素的主要生理作用是促进生根，与细胞分裂素协同可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长[16]，而NAA是兰花组培中最常用的生长素。陈丽等认为，NAA+BA有利于墨兰原球茎的生长、分化[17]，陈小强等在研究大花蕙兰原球茎增殖时发现，NAA+6-BA对大花蕙兰的增殖效果良好[18]，而一般情况下，当生长素/细胞分裂素比例高时抑制不定芽分化、促进生根，反之亦然[19]。原球茎在分化芽苗阶段，由于生根数少而短，易导致炼苗时难以成活，因此，筛选最佳的生根培养基非常重要[20]。相关研究表明，降低6-BA浓度、适当增加NAA的浓度有助于兰花生根。本试验结果表明，不同的6-BA与NAA配比对墨兰与大花蕙兰杂交兰的原球茎增殖与分化、不定芽增殖和生根有明显影响，含6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培养基可获得288.88%的原球茎增殖率和40.97%的分化率；不定芽增殖的最佳激素配比为6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，此时NAA浓度/6-BA浓度为0.15，增殖率为227.5%，当NAA浓度/6-BA浓度>0.15时，不定芽的增殖率递增，而NAA浓度/6-BA浓度<0.15时，不定芽的增殖率随6-BA浓度的增加而递减；高浓度NAA对生根有抑制作用，NAA浓度为 2.0 mg/L 时杂交兰的生根苗数多，生根率为81%，且苗生长健壮。

香蕉对酸碱有很强的缓冲能力，能保持培养基pH值在5.6左右，对植物的生长、增殖具有促进作用，同时香蕉泥还能有效吸收外植体分泌的类多酚氧化物，抑制外植体的褐变、降低其死亡率。李小军等研究发现，香蕉对霍山石斛壮苗有促进作用[21]；王玉英等在辐射诱变的线艺兰快繁技术体系研究中加入了80 g/L香蕉泥[22]。巩振辉等认为，适宜的生根培养基中添加适量的活性炭有助于生根[23-25]。本试验在杂交兰不同培养阶段都添加了80 g/L香蕉泥，这有助于杂交兰组培苗的复壮、减轻褐变现象的出现；而在生根阶段加入1.0 g/L活性炭，此时杂交兰生根率高，根数多且长。

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