低温胁迫对杂交鹅掌楸幼苗活性氧和活性氮代谢的影响

成铁龙， 彭 冶， 施季森， 陈金慧， 杨立明

(1.南方现代林业协同创新中心，江苏南京 210037； 2.南京林业大学生物与环境学院，江苏南京 210037；3. 南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，江苏南京 210037)

鹅掌楸[Liriodendronchinense(Hemsl.)Sarg.]，别称马褂木，是我国南方地区重要的阔叶用材树种，具有速生、材质优良、工业利用价值高等优点，而由中国马褂木和北美鹅掌楸为亲本经过人工杂交育成的种间杂种杂交鹅掌楸具有明显的杂种优势，树干更通直，花叶更秀丽，生长更迅速，目前已成为我国南方地区人工林改造的替代树种[1]。为了扩大杂交鹅掌楸的推广应用范围，特别是进一步在我国北方大面积推广，开展杂交鹅掌楸应对低温胁迫的生物学研究及其耐低温育种研究具有重要意义。

植物低温耐性是其抵御低温危害的重要决定因素，低温抗性的强弱是植物长期适应与进化的结果，并受遗传因素的控制。但是不断增加的研究结果表明，植物对冷害或冻害的耐受是一系列抗逆性相关基因或蛋白转录活化的结果[2]。研究发现，植物受到冷胁迫过程中，抗逆相关基因的转录与表达呈现一种网络状态。通过对含有24 000个拟南芥基因的芯片分析发现，低温可以诱导其中655个基因表达，同时抑制284个基因的转录，表明低温胁迫激活了植物体内基因表达的网络系统，进而调控下游蛋白质和代谢物组分的代谢变化，从而表现出对低温胁迫的耐受或敏感性[3]。

植物应答低温胁迫的早期事件之一是氧化还原系统的变化，特别是活性氧代谢的失调导致的过量积累。过量积累的活性氧能改变植物体内正常的氧化还原状态，进而引发氧化损伤，最后导致生物大分子的破坏以及植物叶片的细胞死亡[4-7]。植物防御系统能够通过酶和非酶催化的抗氧化系统提供足够的保护以消除正常条件下产生的活性氧损失[8]。前期的研究发现，抗氧化系统能够被低温诱导，如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的增加，然而植物体内产生的过量活性氧(ROS)可以破坏防御系统而导致氧化胁迫[8-10]。类似于ROS，一氧化氮(NO)也是一种氧化还原信号分子，能够与ROS的一些分子发生反应[11]，这些反应的产物被称为活性氮(RNS)。最近研究发现，低温胁迫能诱导NO产生，并调控RNS相关物质的基因表达和酶活性[12]。已有报道显示过氧化氢(H2O2)和NO在应答胁迫时具有协同效应，然而在低温胁迫下植物体内活性氧和活性氮系统的变化特征尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用的材料为笔者所在实验室杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系培养获得的再生植株，基因型为1×5002。

1.2 低温胁迫处理

选取在3/4 MS固体培养基中生长良好、高度为5～6 cm的杂交鹅掌楸体细胞胚胎再生植株幼苗，置于恒温培养箱中进行4 ℃低温处理，每2 d观察植株表型并取叶片，处理时间分别为2、4、6 d。低温胁迫6 d后于室温恢复2 d，记为R2处理。每个处理时间点设45株植株。培养条件：温度(4.0±0.5) ℃，光—暗周期为14 h—10 h，光照度350 μmol/(m2·s)，空气湿度65%～70%。

1.3 生理指标的测定

1.3.1 酶活性测定 称取1 g叶片，在液氮中充分碾磨，加入5 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液[5 g/L PVP-40，0.1%(体积分数)TritonX-100，1 mmol/L EDTA (pH值为7.4)，蛋白酶抑制剂]于室温下涡旋20 min，再于4 ℃、8 000g离心 20 min，取上清液用于酶活性的测定。SOD活性的测定参考Beauchamp等报道的方法[13]，CAT活性的测定参考Aebi报道的方法[14]。一氧化氮合成酶(NOS)活性测定使用NOS活性测试试剂盒(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA)，具体方法参考试剂盒的使用说明。称取1 g叶片，在液氮中充分碾磨，加入酶提取试剂[100 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(简称HEPES)-KOH(pH值为7.4)，1 mmol/L EDTA(pH值为7.4)，10% 丙三醇(体积分数)，5 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，10 μmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.1% Triton X-100(体积分数)，10 g/L PVP-40，20 μmol/L黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)]，于室温下涡旋20 min，再于4 ℃、8 000g离心 20 min，取上清液用于NOS活性的测定，具体方法参照González等的报道[15]。

1.3.3 NO含量测定 切取12 mm2大小的叶片置于96孔板中，加10 μm DAF-FM 双乙酸盐[10 mmol/L Tris-HCl(pH值为7.5)]暗室温育10 min，用10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH值为7.5)洗3次后，用荧光仪测定相对NO荧光强度[18-19]。

1.4 数据处理

用SPSS 16.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 低温处理对杂交鹅掌楸幼苗表型的影响

低温胁迫影响了鹅掌楸幼苗的形态。相对于室温条件下，在低温胁迫的1～2 d时间段，叶片有轻微的卷曲，随着胁迫时间的延长，叶片卷曲较为明显，特别是在低温胁迫后 6 d，叶片呈现出较为明显的卷曲，甚至部分植株幼苗出现了萎蔫。但低温胁迫6 d后，解除低温胁迫2 d，幼苗叶片基本恢复到与室温类似的形态(图1)。

2.2 低温胁迫对鹅掌楸幼苗叶片活性氧和活性氮含量的影响

2.2.1 鹅掌楸幼苗叶片应答低温过程中活性氧含量变化 超氧阴离子和过氧化氢是活性氧物质的2个重要成员，环境胁迫会诱导植物产生过量的活性氧物质的积累。研究发现，低温胁迫引起鹅掌楸幼苗叶片超氧阴离子含量先缓慢升高后急剧升高。在低温胁迫2 d时，鹅掌楸幼苗叶片超氧阴离子含量仅仅为对照植株的1.3倍；但当低温胁迫处理4 d和6 d时，超氧阴离子含量分别增加到对照植株的4.8倍和6.6倍。低温胁迫6 d后解除2 d，超氧阴离子含量有所降低，但仍处于较高的水平(图2)。

同样，低温胁迫也导致鹅掌楸幼苗叶片内过氧化氢含量的增加，但与超氧阴离子含量增加趋势有所不同。低温胁迫2 d引起鹅掌楸幼苗叶片过氧化氢含量增加3.9倍，低温胁迫处理4 d和6 d引起过氧化氢含量分别增加到对照植株的5.1倍和7.3倍。低温胁迫6 d后解除2 d，过氧化氢含量仍为对照植物的3.7倍(图3)。

2.2.2 鹅掌楸幼苗叶片应答低温过程中一氧化氮含量变化 低温胁迫引起了鹅掌楸幼苗叶片一氧化氮含量升高。在低温胁迫2 d时，鹅掌楸幼苗叶片一氧化氮含量达到对照植株的2.2倍；但当低温胁迫处理4 d和6 d时，一氧化氮含量分别增加到对照植株的3.7倍和4.8倍；低温胁迫6 d后解除 2 d，一氧化氮含量略有降低，但仍是对照植株的3.4倍(图4)。

2.3 低温胁迫对鹅掌楸幼苗叶片活性氧和活性氮相关酶活性的影响

2.3.1 鹅掌楸幼苗叶片应答低温过程中活性氧清除酶系的活性变化 通过测定植物体内2个关键的清除活性氧的酶SOD和CAT活性，可以了解二者在低温胁迫过程中的防御作用。SOD是体内清除超氧阴离子的酶，可以将体内过量的超氧阴离子催化生成过氧化氢，进而分解成水，从而解除超氧阴离子过量积累造成的伤害。低温处理鹅掌楸幼苗植株，引起叶片内SOD活性的增加，且随着胁迫处理时间的延长酶活性逐渐升高(图5)。与室温条件相比，低温胁迫处理2 d诱导SOD活性增加了1.6倍；胁迫处理4 d和6 d时SOD活性增加了2～3倍；当胁迫6 d后解除胁迫条件恢复到室温2 d后，SOD活性降低到低温胁迫处理4 d时的水平(图5)。

CAT可以有效地将植物体内过氧化氢分解，维持机体内过氧化氢的动态水平。鹅掌楸幼苗植株在低温胁迫下，CAT活性急剧升高，在低温胁迫的2 d，CAT活性增加了2.8倍，随着胁迫时间的延长，CAT活性缓慢升高。在胁迫6 d后恢复到室温2 d后CAT活性又降低到低温胁迫2 d时的水平(图6)。

从上述结果可见，鹅掌楸幼苗叶片活性氧清除酶系SOD和CAT活性在应答低温胁迫期间逐渐增强；相较于室温生长条件下的对照植株，尽管解除低温胁迫降低了SOD和CAT的活性，但它们在低温胁迫后的植株内仍保持较高的水平。

2.3.2 鹅掌楸幼苗叶片应答低温过程中一氧化氮合成酶的活性变化 NOS是催化一氧化氮合成的重要的酶。上述研究观察到在鹅掌楸幼苗叶片中低温诱导NO的快速增加，为了调查NOS对这一过程的作用，研究发现低温胁迫诱导了NOS活性的增加。在胁迫处理的2、4、6 d，NOS活性分别增加了约40%、80%、110%，胁迫恢复后，NOS活性降低到对照植株NOS活性的1.6倍(图7)。

3 结论与讨论

在植物应答胁迫的早期阶段活性氧能够被诱导，并且被认为是植物体内传递胁迫信号的第二信使。但是当胁迫处理到一定程度时植物体内会产生过量的活性氧，并损伤植物体[20]。因此，调查胁迫状态与活性氧积累的特征变化谱有助于了解植物应答胁迫的生理生化机制。研究发现，低温胁迫下杂交鹅掌楸幼苗叶片内超氧阴离子自由基、过氧化氢等活性氧物质含量显著增加，特别是随着胁迫处理时间的延长，活性氧积累得更多。这可能是由于低温胁迫打破了植株体内氧化还原系统的平衡状态，使活性氧产生的速度超过了活性氧清除的速度，引起了活性氧含量的增加。为了避免植物体内由于活性氧积累造成的氧化伤害，植物拥有复杂的抗氧化系统来清除活性氧，其中SOD和CAT是2个主要的催化分解超氧阴离子自由基和过氧化氢的抗氧化酶，可以防止活性氧的过量积累。本研究中，低温胁迫诱导了杂交鹅掌楸幼苗叶片内SOD、CAT活性的增强，SOD、CAT活性在低温胁迫过程中增强可能是为了降低过量积累的活性氧对植物体的伤害。

低温胁迫与活性氮代谢也密切相关[21]。研究发现，低温胁迫也引起了杂交鹅掌楸幼苗叶片内一氧化氮含量的增加，该结果显示一氧化氮参与到植物应答低温胁迫的机制中；一氧化氮含量的应答变化趋势与一氧化氮合成酶活性的增加呈正相关，由此暗示NOS活性也许被上调以便产生更多的一氧化氮来应答低温胁迫。

已知活性氧和活性氮代谢是紧密相连且交叉反应的系统，活性氧和一氧化氮能直接相互作用生成过氧亚硝基阴离子等活性氮物质[22]。本研究中，低温胁迫扰乱了活性氧和活性氮的平衡状态，引起了活性氧和活性氮含量增加，而其自身防御系统调动了活性氧清除酶的活性以降低活性氧含量，以减缓其对植物体的氧化伤害(图8)。

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