中国美利奴羊TLR4基因多态性的PCR—SSCP鉴定

王会敏　罗成　齐江姣　王元元　李村院　高剑峰

摘要：为了研究中国美利奴羊TOLL样受体（TLR4）基因第3外显子上的单核苷酸多态性（SNPS）和单氨基酸多态性（SAPS）。利用生物信息学方法对NCBI上公布的有关绵羊的TLR4序列进行下载并用SeqMan对下载的绵羊TLR4基因外显子进行多态性比对分析，然后采用PCR-SSCP并结合测序的方法对119只中国美利奴羊TLR4基因的外显子3的扩增片段进行分析。通过分析发现，在中国美利奴羊第3外显子1 180 bp处有1个突变位点，由G突变成T，氨基酸由天冬氨酸（D）变成酪氨酸（Y），即该位点为有义突变。在1 537 bp处也有1个突变位点，即由G突变成了A，氨基酸由丙氨酸（A）变成苏氨酸（T），在TLR4第3外显子的其他位点并没有SNPS位点，说明中国美利奴羊TLR4基因上的第3外显子区域有2个多态位点。

关键词：中国美利奴羊；TLR4基因；多态性；生物信息学方法；PCR-SSCP；外显子；突变位点

中图分类号： S8268+62文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0027-05

收稿日期：2016-06-30

基金项目：国家“973”计划（编号：2010CB530200）。

作者简介：王会敏（1990—），女，硕士研究生，研究方向为动物基因工程。

通信作者：高剑峰，博士，教授，研究方向为动物功能基因组学与分子免疫学。E-mail：jianfengg@shuzueducn。

Toll样受体（toll-like receptor，TLR）最早是从果蝇体内分离得到的，它对果蝇腹背侧体轴的发展方向和非特异性免疫反应起重要的作用[1]。Medzhitov等首次在人体分离出果蝇TLR的同系物，从而发现人类及哺乳动物存在一个TLR家族，它是一种重要的模式识别受体，能识别微生物的多种成分如DNA、RNA、脂多糖、脂蛋白等，从而激活非特异性和特异性免疫反应，抵抗细菌、病毒的侵入[2]。TLR家族至少有10个TLR成员，它们分别在不同的免疫应答机制中扮演各自的重要角色。TLR基因的多态性可以使机体对疾病的遗传具有易感性和抗性，基因TLR位点多态性与炎性应答损伤和感染性疾病的遗传易感性相关[3-5]。TOLL样受体4是一种Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含半胱氨酸的胞内区、富含亮氨酸的胞外区和跨膜区[6]。TLR4广泛表达于哺乳动物细胞表面，在抗感染免疫中发挥重要作用。目前，关于TLR4的多态主要集中在人和小鼠的研究上。例如，刘继峰等对TLR2、TLR4基因多态性[CM（25]与尖锐湿疣患者易感性及复发性的相关性进行研究[7]。韩璐等TLR4基因的多态性与胃癌的关系[8]。赵刚等利用 PCR-SSCP方法研究牛血液组胺浓度、TLR4基因多态性与抗蜱能力的关系发现，B等位基因可作为婆罗门杂交牛抗蜱选育的分子标记[9]。吕伟丽等用 PCR-SSCP 方法检测这4 种绵羊第3外显子的多态性发现，白萨福克羊、小尾寒羊和特克塞尔羊处于高度多态，而永昌羊处于中度多态[10]。鲜有关于绵羊TLR4基因的多态性与疾病关联的报道。中国美利奴绵羊是新疆绵羊毛肉兼用细毛羊品种的一种，具有优良的遗传稳定性，包括军垦型、科尔泌型、吉林型3种类型[11]。本试验以中国美利奴羊为材料，利用生物信息学方法对NCBI上公布的有关绵羊的TLR4序列进行下载并用SeqMan对下载的绵羊TLR4基因外显子进行多态性比对分析，然后采用 PCR-SSCP技术并结合克隆测序的方法来检测中国美利奴羊TLR4基因的多态位点，从而为进一步研究标记辅助育种、培育中国美利奴绵羊抗性新品系奠定理论基础。

1材料与方法

11材料

111试验动物试验中的119只中国美利奴羊来自新疆建设兵团农九师第170团，取每只试验羊的颈静脉血于5 mL肝素钠抗凝管中，放入车载冰箱里带回实验室，然后放入 -40 ℃ 保存备用。

112主要试剂血液基因组试剂盒、EB（核酸染料）、2×Taq PCR MasterMix、DL 2000 DNA Marker等，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；过硫酸铵和去离子甲酰胺，均购自北京索莱宝科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和 TEMED，均购自美国 Am-resco公司；亲和硅烷、剥离硅烷，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。其他试剂均由实验室配制。

12方法

121生物信息学分析从NCBI上通过绵羊基因mRNA序列（登录号：XM_012111214 ）下载绵羊的编码区，并利用NCBI上的http：wwwncbinlmnihgovgene？term=CAQ378251&report=gene_table将TLR4基因的编码区进行外显子的划分。

122利用生物信息学方法对NCBI上公布的有关绵羊TLR4所有的mRNA序列进行下载并用SeqMan软件对下载的绵羊TLR4基因外显子的序列进行多态性比对分析找出位于其品种羊的多态位点并分析。

123基因组DNA的提取[JP3]采用血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA，用紫外分光光度计估计浓度并用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA浓度，于-80℃保存备用。

124PCR扩增反应根据NCBI上公布的绵羊TLR4基因的序列（登录号：XM_012111214 ）利用Primer Premier 50设计扩增TLR4第3外显子的特异性引物，引物信息见表1。引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

TLR4基因的第3外显子（即表1中）的所有片段的反应总体系都为20 μL：ddH2O 8 μL，Tap PCR MasterMix 8 μL，DNA模板20 μL，上、下引物（10 μmolL）各10 μL。PCR擴增程序：95 ℃预变性5min；95 ℃变性1 min，72 ℃延伸 40 s，35个循环；72 ℃总延伸10 s；4 ℃保存。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶系统照相检测扩增结果。endprint

125PCR-SSCP检测和测序分析

分别取45 μL的PCR扩增产物与90 μL的变性上样缓冲液（025%二甲苯菁、005%溴酚蓝、95%去离子甲酰胺、pH值为80 的EDTA）离心混匀，于PCR仪上98 ℃变性10 min，然后取出立即冰浴 5 min。快速在预先制备好的10%非变性聚丙烯酰氨凝胶（90 mL 10×TTE，225 mL 40%丙烯酰胺，580 mL ddH2O，最后同时加入4500、700 μL TEMED）上点样并连接至冷凝循环系统，9 ℃、300 V预电泳15 min，45 mA电泳5 h，结束后采用银染色法显色并在X光上分析带型且拍照保存。

选择有不同带型样品的PCR产物经电泳检测符合测序要求后，送北京六合华大基因科技有限公司进行双向测通测序，然后用SeqMan和GenDoc等软件对测序序列进行比對分析。

2结果与分析

21用生物信息学对绵羊TLR4基因编码区外显子的划分[HT]

TLR4基因的编码区分为3个外显子：外显子1是从TLR4编码区序列的1～90长93 bp、外显子2是从TLR4编码区序列的91～257长167 bp、外显子3为TLR4编码区序列的258～2 523长2 266 bp（图1）。

22不同品种绵羊TLR4基因外显子3的生物信息学分析[HT]

用SeqMan软件对从NCBI上下载的所有有关绵羊TLR4的mRNA序列进行多态性比对分析发现，其多态位点主要集中位于TLR4基因第3外显子的316～532、530～753、821～1 066、1 093～1 370、1 382～1 634、1 867～2 098 bp之间。其中，316～532 bp 之间共有9个SNP位点，含有A→C、T→C的突变各2个，A→G突变4个，G→C突变1个；530～753 bp之间共有8个SNP位点，含有C→T、A→G、A→C的突变各2个，G→C、T→C的突变各1个；821～1 066 bp之间共有23个SNP位点，含有A→G突变6个，G→A突变4个、G→T突变3个，T→C、C→T突变各2个，C→A、G→C、T→A、C→G、A→T、T→CG 各1个； 1 093～1 370 bp之间共有20个SNP位点，

含有C→T突变6个、G→A突变5个、 A→G突变5个、G→C、G→T、A→T、C→G的突变各1个；1 382～1 634 bp之间共有11个SNP位点，含有T→C突变2个、G→A突变5个、A→C突变1个、C→T突变2个、A→G突变1个；1 867～2 098 bp之间共有9个SNP位点，其中C→A突变1个、C→T突变2个、G→A突变3个、A→G突变3个。G→C、G→T各占所有突变位点的5%、A→T、C→G、C→A各占所有突变位点的250%、T→A、T→CG各占所有突变位点的125%、T→C占所有突变位点的875%、C→T占所有突变位点的1750%、A→G占所有突变位点的2625%、A→C占所有突变点的625%、G→A占所有突变位点的2125%。从上述统计结果来看，G与A（即为转换位点）之间的突变在绵羊的TLR4的第3外显子中比较常见，C→T突变次之，且有1个T→CG即简约信息位点。绵羊TLR4基因第3外显子的所有突变位点中既有转换位点又有颠换位点，且转换位点多于颠换位点。可能是由于DNA双螺旋结构的差异，越是结构相似的碱基越易相互替换。

23基因组DNA电泳图检测结果

提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，由图2可见，电泳条带清晰单一，可以进行下步试验。

24绵羊TLR4基因第3外显子片段的PCR扩增[HT]

由图3可知，绵羊TLR4基因第3外显子TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）的PCR扩增，上述序列的扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测与目的片段大小一致且带型清晰、无杂带符合SSCP试验要求。

25PCR-SSCP检测

对绵羊TLR4基因第3外显子的TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）扩增得到的PCR产物进行SSCP试验检测，在扩增片段中都没有发现多态性都为AA[CM（245]基因型（图4-A至图4-D）；TLR4（1 093～1 370）与

[FK（W13][TPWHM222tif]

TLR4（1 382～1 634）PCR扩增得到的产物进行SSCP试验，在扩增产物片段中发现不同的带型，即TLR4（1 093～1 370）有AA、AB、BB等3 种基因型TLR4（1 382～1 634）有2种基因型AA、AB（图4-E至图4-F）。

26绵羊TLR4第3外显子的TLR4（1 093～1 370）与TLR4（1 382～1 634）序列的测序结果[HT]

通过测序和SeqMan软件的比对分析（图5至图6）可知，在TLR4基因第3外显子的1 180 bp处有1个突变位点，由G突变成T，氨基酸由天冬氨酸（D）变成酪氨酸（Y），即该位点为有义突变。在TLR4基因第3外显子的1 537 bp处也有1个突变位点，即由G突变成了A，氨基酸由丙氨酸（A）变成苏氨酸（T）该位点为有义突变。

3讨论与结论

目前，国内外学者在人TOLL样受体的多态性方面研究得比较广泛。Mu等发现，人的TLR9-1486TC和2848GA 的基因型能增加患宫颈癌的风险[12]。吴春香等采用PCR-FLRP技术对110例AAV患者及101例健康的成人进行研究，发现TLR4-1837AG基因型影响AAV患者的血红蛋白、endprint

[血尿发生率、血沉水平、C反应蛋白[13]。林茂虎等用iMLDR 技术对 423 例鲍曼不动杆菌感染病人和 385 例非感染病人的血标本进行 TLR4基因的多态性检测，证明位于启动子区域的TLR4单倍型 GCG与鲍曼不动杆菌感染的相关性[14]。王永堂等用PCR-RFLP技术对正常汉族人群样本TLR4启动子区 -2 242、-1 892 和 -1 837 这 3 个多态位点进行基因分型，证明中国汉族人群中位于TLR4基因启动子区的 -2 242 位点可能是脓毒症关联分析重要的遗传标记[15]。从以上可知，TLR4基因的多态性在人方面研究得比较成熟，但其在家畜方面研究得比较少，有待进一步研究，TLR4基因具有SNPs的免疫基因，而基因多态性能够与生产性能上的一些经济性状联系起来，为动物遗传育种提供一定的依据。同时，TLR基因多态性与动物的免疫力及疾病的易感性和抗病性也有很大关联性。绵羊是这个星球上最有经济价值的家养动物之一，在工农业生产中占据着重要的地位。羊肉蛋白質含量高、胆固醇含量低、营养丰富，是世界上很多人喜爱的食物[16]，2012年中国的出口羊肉产量为401万t，占世界的32%。优质羊毛是毛纺工业的重要原材料，此外绵羊也是重要的科学研究模式动物。因此，对于选育具有优良品种和抗性新品系的绵羊尤为重要，必须从多个方面考虑、创新、发现新的有关提高绵羊经济价值领域。在本试验中，将中国美利奴羊的TLR4编码基因的第3外显子分成7个在300 bp以下的片段，分别为TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）来检测TLR4编码基因第3外显子在中国美利奴羊上的多态性，因为TLR4编码基因的第3外显子总长为2 266 bp，而做SSCP试验DND片段总长最好在 300 bp 以下，这样检测到目的DNA片段多态性的灵敏度才高[17]。对以上TLR4编码基因的7个片段进行多态检测，除TLR4（1 093～1 370）与TLR4（1 382～1 634）片段中各有1个有义突变外，其他片段都没有多态，这种现象可能是因为中国美利奴羊TLR4基因在所检测的区域是比较保守的，由此也可得出中国美利奴羊具有多态位点的改变。有关更多的突变基因可能位于中国美利奴羊TLR4基因的其他外显子或启动子区、调控区域，还有可能是检测样本量和羊所选地区偏少导致的。因此，须要扩大样本的数量和对多个地区的中国美利奴羊进行进一步的研究。

参考文献：

[1][ZK（#][JP2]Hashimoto C，Hudson K L，Anderson K V The toll gene of drosophila，required for dorsal-ventral embryonic polarity，appears to encode a transmembrane protein[J] Cell，1988，52（2）：269-279

[2]韩凝，张彩，罗南萍 TLR4研究进展与肾脏疾病[J] 放射免疫学杂志，2009，22（2）：133-135

[3]Kiechl S，Lorenz E，Reindl M，et al Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis[J] New England Journal of Medicine，2002，347（3）：185-192

[4]Szomolanyi-Tsuda E，Liang X，Welsh R M，et al Role for TLR2 in NK cell-mediated control of murine cytomegalovirus in vivo[J] Journal of Virology，2006，80（9）：4286-4291

[5][JP3]张欣，张小丽，马小军，等 甘肃高山细毛羊TLR2基因遗传多态性及其与乳房炎相关性[J] 江苏农业学报，2015，31（6）：1357-1361

[6]李静，姜相君 Toll样受体及其基因多态性与胃黏膜疾病相关性的研究进展[J] 胃肠病学，2015（7）：431-434

[7]刘继峰，瞿镔，王向东，等 TLR2、4基因多态性与尖锐湿疣患者易感性及复发的相关性研究[J] 中华男科学杂志，2015，21（8）：708-712

[JP2][8]韩璐，赵真真，王笑峰，等 TLR3和TLR4基因多态性与EBV相关胃癌易感性的关系[J] 肿瘤防治研究，2015，42（1）：14-18

[9]赵刚，余梅，崔群维，等 牛血液组胺浓度、TLR4基因多态性与抗蜱能力的关联分析[J] 中国奶牛，2015（6）：1-5

[10][ZK（#]吕伟丽，马小军，张小丽，等 绵羊TLR4基因的遗传多态性分析[J] 江苏农业学报，2014，30（4）：790-795

[11]刘守仁，邵长发，张凤林，等 中国美利奴羊（新疆军垦型）多胎品系的选育研究[J] 畜牧与兽医，1995（6）：246-248

[12]Mu X Y，Zhao J，Yuan X，et al Gene polymorphisms of Toll-Like receptor 9 -1486TC and 2848GA in cervical Cancer risk[J] International Journal of Gynecological Cancer，2015，25（7）：1173-1178

[13]吴春香，薛超，廖蕴华，等 TLR4基因1837AG多态性与广西汉族人群原发抗中性粒细胞胞浆抗体相关性小血管炎的相关性[J] 广东医学，2015（4）：528-531

[14]林茂虎，朱晓应，苗芮，等 TLR-2和TLR-4受体单核苷酸多态性与鲍曼不动杆菌感染的相关性[J] 解放军医学院学报，2015（8）：829-831

[15]王永堂，蒋建新，段朝霞，等 TLR4基因启动子区多态性及其对蛋白表达的影响[J] 现代生物医学进展，2009，9（7）：1209-1212

[16]Gao J，Liu K，Liu H，et al A complete DNA sequence map of the ovine major histocompatibility complex[J] BMC Genomics，2010，11（11）：466

[17]李玉梅，姚纪元，吴静，等 PCR-SSCP技术的研究及应用进展[J] 生物技术通报，2007（6）：71-74endprint