中药复方多糖对不同MHC B—LβⅡ基因型鸡新城疫抗体和免疫球蛋白IgG、IgM含量的影响

杨红洋+朱晓庆+商云霞+谷新利+郭晓

摘要：為探究MHC B-LβⅡ基因多态性对中药复方多糖免疫调节剂量的影响，采用PCR-SSCP方法将500羽黄麻肉鸡按不同MHC B-LβⅡ基因型分组，再将各组分成高、中、低剂量中药复方多糖组和空白对照组。分别于8日龄皮下注射50.0、25.0、12.5 mg/mL中药复方多糖和生理盐水各0.2 mL/只，连续注射7 d，于21、42、56、70日龄各组随机取5只试验鸡，翅静脉采血分离血清，测定血清中新城疫（newcastle disease，简称ND）抗体和IgG、IgM的含量。结果显示，多糖能提高MHC B-LβⅡ不同基因型鸡新城疫抗体和IgG、IgM含量，且高剂量组中药复方多糖组中AB基因型个体血清中新城疫抗体含量最高，AA基因型个体血清中IgG、IgM含量最高；中、低剂量中药复方多糖组中AB基因型个体血清中新城疫抗体含量和IgG、IgM含量最高。表明中药复方多糖能提高不同MHC B-LβⅡ基因型鸡的免疫力，且中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因鸡的最适免疫调节剂量不同。

关键词：中药复方多糖；MHC B-LβⅡ基因；新城疫；免疫球蛋白IgG和IgM；鸡

中图分类号： S853.74 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0168-05

收稿日期：2016-11-29

基金项目：国家自然科学基金（编号：31460673）。

作者简介：杨红洋（1987—），男，山东菏泽人，硕士研究生，研究方向为临床兽医学。E-mail：hongyangy527@126.com。

通信作者：商云霞，高级实验师，从事动物疫病防治研究，E-mail：shangyunxia@shzu.edu.cn；谷新利，博士，教授，从事中药制剂开发与应用方面研究，E-mail：xlgu@shzu.edu.cn。 免疫能力的高低决定了机体抵抗病原能力的大小，直接影响经济动物的生长和生产。注射疫苗能有效地提高机体抵抗病原的能力，并且当疫苗与免疫增强剂配合使用时能显著增强疫苗的防疫效果。目前，国内外广泛使用的油乳剂、铝胶类等化学性免疫增强剂常具有副作用大、局部刺激性强、致癌等弊端。大量研究表明，从中草药中提取的多糖不仅能增强机体免疫力，还具有毒副作用小、残留量低等优点，成为开发疗效确定、低毒免疫增强剂的理想药物。

鸡主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，简称MHC）最初是作为具有高度多态性的红细胞抗原而被认识，之后将该基因的基因座标记为B，即B复合体[1]，是一个与机体免疫应答、抗病性能密切相关的多基因家族，具有高度的多态性。鸡MHC至少包含3个亚区，即B-F、B-L、B-G区[2]。其中，B-L区基因编码MHCII类分子，主要负责递呈外源性抗原，供CD4+T细胞识别，诱导细胞因子分泌，调节机体抗体的产生，参与机体细胞免疫和体液免疫反应[3]。MHC B-LβⅡ基因是MHCII类抗原的结合区，具有丰富的多态性和功能特异性[4]。

有研究表明，多糖能被MHCII分子呈递而被αβ-T细胞的TCR（T cell receptor）直接或者间接识别，激活B淋巴细胞，诱导特异性抗体产生[5]。而鸡MHC基因多态性使得不同个体对相同抗原有不同免疫反应，从而导致机体免疫功能存在个体差异，进而可能影响中药多糖最适免疫增强剂量。因此，本研究采用PCR-SSCP方法对试验鸡进行MHC B-LβⅡ基因分型后，给予不同剂量中药复方多糖，通过测定各组试验鸡新城疫抗体和IgG、IgM等2种免疫球蛋白含量，探讨MHC B-LβⅡ基因多态性对中药复方多糖提高鸡体液免疫的最佳使用剂量是否有影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 中药复方由当归、党参、熟地、川芎、山楂、何首乌、淫羊藿、麦冬、茯苓、补骨脂和黄芪11味中药组成，各单味药均购自新疆石河子市医药公司。中药多糖（质量百分浓度w=77.10%）由石河子大学化工学院提供。用灭菌蒸馏水将中药复方多糖配制成高剂量（50 mg/mL）、中剂量（25 mg/mL）、低剂量（12.5 mg/mL）3个质量浓度。

1.1.2 药品与试剂 新城疫活疫苗购自新疆石河子市八师兽医站；鸡新城疫抗体（NDV-Ab）酶联免疫分析试剂盒购自北京城林生物技术有限公司；鸡IgG、IgM ELISA检测试剂盒购自上海蓝基生物有限公司；血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 试验动物及分组 500羽1日龄黄麻肉鸡购自新疆石河子市孵化场，临床检查其健康情况。根据MHC B-LβⅡ基因第2外显子PCR-SSCP的检测结果进行分组，再将各组分成高、中、低剂量中药多糖组和空白对照组。分别于8日龄皮下注射50.0、25.0、12.5 mg/mL中药复方多糖及生理盐水各 0.2 mL/只，连续注射7 d。

所有试验鸡于7日龄进行新城疫疫苗的点眼和滴鼻免疫，27日龄进行2免，并且均采用相同的饲养方法、饲养条件、饲料品质和饲养管理进行常规饲养。

1.1.4 试验仪器 酶标仪（美国热电FC型号）、微量移液器、恒温培养箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 分别采集500羽鸡的外周血，按照DNA提取试剂盒说明书提取鸡全血DNA，4 ℃冰箱储存备用。

1.2.2 引物设计 参照GenBank收录的鸡MHC B-LβⅡ基因序列（NC_006103.2）第2外显子信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成引物设计和合成，扩增目的条带大小为308 bp，上游引物Forward：5′-CTGAATACTGGAAC AGCAACG-3′，下游引物Reverse：5′-ACCACTTCACCTC GATCTCC-3′。endprint

1.2.3 PCR擴增 扩增反应总体积为20 μL，其组成为Mix 12 μL，上、下游引物各1 μL，基因组DNA 1 μL，灭菌ddH2O 5 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 保存。

1.2.4 PCR-SSCP基因型检测 3 μL PCR产物与8 μL上样缓冲液（98%甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10 mmol EDTA）混匀后98 ℃水浴变性10 min，立即冰浴 10 min。样品在8%非变性聚丙烯酰氨凝胶中电泳。电泳结束后，进行银染并用聚焦成像系统进行拍照。

1.2.5 鸡血清新城疫抗体和IgG、IgM的含量测定 每组抽取5只试验鸡，于21、42、56、70日龄翅静脉采血，常规分离血清。根据鸡新城疫抗体及IgG、IgM酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）检测试剂盒说明书进行操作，用酶联免疫检测仪测定样品在450 nm波长处的吸光度（D值），并根据ELISA检测试剂盒中标准品浓度及其对应的D值获得标准曲线的直线回归方程，再根据样品的D值利用回归方程计算出相应样品的新城疫抗体和IgG、IgM的含量。

1.3 数据分析

数据结果均以平均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS 19.0对试验数据进行方差分析和多重比较。所有统计分析结果以P<0.05作为差异显著性的判断标准。

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP基因型检测

对所有DNA样品进行PCR-SSCP基因型检测，发现有5种基因型，即AA基因型（共186羽），AB基因型（共180羽），BB基因型（共68羽），AC基因型（共35羽），AD基因型（共31羽）（图1）。

2.2 中药复方多糖对不同MHC B-L βⅡ基因型鸡血清中新城疫抗体含量的影响

由表1可知，与空白对照组相比，各剂量中药复方多糖均能提高不同基因型鸡新城疫抗体含量，但在同一剂量中药复方多糖组和空白对照组中，不同基因型鸡血清中新城疫抗体含量不同。其中，高剂量中药复方多糖组21、42日龄AB基因型鸡血清中新城疫抗体含量显著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），56日龄AB基因型的新城疫抗体含量显著高于AC、AD基因型（P<0.05），70日龄AB基因型的新城疫抗体含量显著高于AA、AC、AD基因型（P<0.05）；中剂量中药复方多糖组21日龄AB基因型鸡血清中新城疫抗体含量显著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AC基因型的新城疫抗体含量显著高于AA、BB、AD基因型（P<0.05），42日龄AB基因型的新城疫抗体含量显著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AC基因型的新城疫抗体含量显著高于AD基因型（P<0.05），56日龄AB基因型的新城疫抗体含量显著高于AA、BB、AD基因型（P<0.05），70日龄AB基因型的新城疫抗体含量显著高于AD基因型（P<0.05）；低剂量中药复方多糖组21日龄AB基因型鸡血清中新城疫抗体含量显著高于BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的新城疫抗体含量显著高于AC、AD基因型（P<0.05），42日龄AB基因型的新城疫抗体含量显著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的新城疫抗体含量显著高于BB、AD基因型（P0.05）；空白对照组各日龄AA基因型鸡血清中新城疫抗体含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，但无显著性差异（P>0.05）。

2.3 中药复方多糖对不同MHC B-L βⅡ基因型鸡血清中IgG含量的影响

由表2可知，与空白对照组相比，各剂量中药复方多糖均能提高不同基因型鸡的IgG含量，但在同一剂量中药复方多糖组和空白对照组中，不同基因型鸡血清中的IgG含量不同。其中，高剂量中药复方多糖组21、42日龄时AA基因型鸡血清中IgG含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，但无显著性差异（P>0.05），56日龄时AA基因型的IgG含量显著高于AC、AD基因型（P<0.05），70日龄时AA基因型的IgG含量显著高于BB、AC、AD基因型（P005）。

2.4 中药复方多糖对不同MHC B-L βⅡ基因型鸡血清中IgM含量的影响

由表3可知，与空白对照组相比，各剂量中药复方多糖均能提高不同基因型鸡IgM含量，但在同一剂量中药复方多糖组和空白对照组中，不同基因型鸡血清中IgM含量不同。其中，高剂量中药复方多糖组21日龄AA基因型鸡血清中IgM含量显著高于AB、BB、AC、AD基因型（P<0.05），42日龄时AA基因型的IgM含量显著高于BB、AC、AD基因型（P<005），56、70日龄时AA基因型的IgM含量显著高于AB、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AB基因型的IgM含量显著高于AD基因型（P<0.05）；中剂量中药复方多糖组各日龄AB基因型鸡血清中IgM含量显著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），并且21日龄时AA基因型的IgM含量显著高于AD、AC基因型（P<0.05）；低剂量中药复方多糖组21日龄时AB、AA基因型鸡血清中IgM含量显著高于BB、AD基因型（P<0.05），42日龄时AB、AA基因型的IgM含量显著高于AC基因型（P<0.05），56日龄时AB基因型的IgM含量显著高于BB、AC、AD基因型（P<0.05），70日龄时AB基因型的IgM含量显著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），AA基因型的IgM含量显著高于AC、AD基因型（P<0.05），BB基因型的IgM含量显著高于AD基因型（P<0.05）；空白对照组各日龄AB基因型鸡血清中IgM含量显著高于AA、BB、AC、AD基因型（P<0.05），并且在42日龄时AA基因型的IgM含量显著高于AC基因型（P<0.05），70日龄时AA基因endprint

型的IgM含量显著高于AC、AD基因型（P<005）。

3 讨论

新城疫是由新城疫病毒（newcastle disease virus，简称NDV）引起的一种鸡急性、败血性、热性以及高度接触性的传染病，一旦发病，在鸡群中会迅速传播，造成鸡的大批死亡。新城疫抗体滴度是鸡对新城疫疾病免疫状态的一个重要指标，能够反映出鸡对新城疫的免疫水平，同时也能反映出鸡的体液免疫水平[6-7]。杨庆芳等研究了黄芪多糖（ASP）、淫羊藿多糖（EPP）和板蓝根多糖对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响，发现3种中药多糖均可提高新城疫HI抗体效价[8]；Liang等的研究证实，泰山刺洋槐多糖（Taishan Robinia pseudoacacia polysaccharides，简称TRPP）作为免疫佐剂可促进新城疫疫苗免疫的雏鸡免疫器官发育，提高新城疫疫苗抗体效价，而且还可以提高十二指肠中SIgA的含量[9]。在本试验中，与空白对照组相比，高、中、低剂量中药复方多糖均能不同程度提高鸡ND抗体含量，并且在42日龄时达到峰值，之后逐渐降低，其主要原因是本试验中27日龄时使用的是新城疫活疫苗，它在接种后7～9 d可产生保护力，接种后2周抗体可达到峰值。

IgG、IgM是由活化的B淋巴细胞产生的主要免疫球蛋白，反映体液免疫状况[10]。其中，IgG是血清和体液中抗体的主要成分，其含量占整个血清免疫球蛋白的70%～75%，主要参与机体再次体液免疫应答，具有调理吞噬作用、凝集反应和沉淀抗原、中和病原体和毒素、活化补体传导途径的作用[11]。IgM含量占免疫球蛋白总量的10%，是活化B细胞受抗原刺激后產生最早的免疫球蛋白[12]。IgM具有很强的抗原结合能力，在机体初期的体液免疫防御中有着重要的地位。陈强等在雏鸡日粮中添加黄芪多糖之后发现雏鸡IgG、IgM 2种免疫球蛋白的分泌量增加[13]；何雯娟等研究表明，黄芩多糖能够提高鸡的免疫器官指数，并且能够提高鸡免疫球蛋白水平，对鸡的免疫能力有提高作用[14]。本试验结果显示，与对照组相比，高、中、低剂量中药复方多糖在各日龄均能不同程度地提高鸡血清中的IgG、IgM含量，增强了雏鸡免疫力，与文献报道结果一致。

自MHC基因发现以来，已有大量的研究表明该基因的突变会引起不同个体对相同抗原表现出不同的免疫反应，从而导致机体免疫功能存在个体差异。刘立波研究了鸡MHC B-L基因SNPs单倍型与绵羊红细胞抗体滴度（SRBC）、禽流感（AI）及新城疫（ND）抗体滴度等5个免疫性状关系，结果表明，每个免疫性状与多个突变位点存在显著相关，且有多个优势单倍型，反映了不同个体之间存在免疫应答能力的差异[15]。在本试验的空白对照组中，不同MHC B-LβⅡ基因型鸡ND抗体和IgG、IgM含量不同，其中，AA基因型鸡血清中ND抗体含量略高于AB、BB、AC、AD基因型，AB基因型鸡血清中的IgG、IgM含量略高于其他基因型鸡，表明MHC B-LβⅡ基因多态性会引起机体免疫功能的个体差异。周伟等研究发现，不同MHC基因型狼山鸡的IgG、IgM含量存在一定差异[16]，这与本研究结果一致。

另外，中医药自古就讲求用药个体化，基因组学的发展为个体化用药提供了理论支持。当遗传变异和药物疗效之间的相互作用逐渐受到人们关注时，将基因组的研究应用于药物治疗领域逐渐增多。随着各国学者从细胞、分子、基因等不同水平对多糖免疫调节机理的深入研究，发现从中草药中提取的多糖不仅能增强机体免疫力，也是一种T细胞依赖性抗原，它能被MHCⅡ类分子处理和呈递，进而被TCR识别[5]，参与机体细胞免疫和体液免疫反应。在本试验中，当对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡进行中药复方多糖处理后，不同剂量中药复方多糖组中MHC B-LβⅡ的优势基因型不同。其中，高剂量中药复方多糖组中AB基因型个体ND抗体含量最高，AA基因型个体IgG、IgM含量最高，中、低剂量中药复方多糖组中AB基因型个体ND抗体含量和IgG、IgM含量最高。出现不同剂量中药复方多糖组中优势基因型不同的原因可能是：（1）MHC基因丰富的多态性会导致MHCII类分子抗原肽结合槽的结构不同，TCR在识别被呈递的细胞表面抗原时也要识别细胞上的MHCII类分子，中药多糖中的活性成分或杂质作为一种外来抗原被MHCII类分子提呈给T细胞的能力和激活B细胞的能力不同，导致不同浓度中药复方多糖组中不同基因型个体T、B淋巴细胞增殖能力及抗体产生量不同，免疫功能存在差异；（2）免疫系统对抗原的感知有数量和浓度上的敏感性差异，多糖的浓度过高或者过低均不会产生较高的免疫应答，从而引起机体免疫水平的差异；（3）免疫性状除受MHC B-LβⅡ基因调控外，还受到其他突变位点或者基因的调控，不同的突变位点引起的免疫性状的变化不同，可对抗体和免疫球蛋白的产生具有调节作用。

以上结果说明，MHC B-LβⅡ基因多态性使鸡的免疫能力产生个体差异，并且对提高鸡血清中的ND抗体含量和IgG、IgM含量的最适多糖浓度会有一定影响。

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