响应曲面法与正交法在二氧化碳超临界萃取桑叶总黄酮中的比较

缪伟伟+王志雄+石仝雨+大野優子

摘要：为探索桑叶中总黄酮提取的最佳方案，利用超临界二氧化碳萃取技术，依次用响应曲面法和正交试验法考查萃取压强、萃取温度、萃取时间、夹带剂无水乙醇的流速对桑叶中总黄酮得率的影响，优选出桑叶黄酮类化合物在使用超临界萃取装置时提取的最佳工艺。结果发现，正交试验的最佳萃取条件为萃取压强25 MPa，萃取温度40 ℃，萃取时间3 h，夹带剂无水乙醇流速2.5 mL/min，在此試验条件下总黄酮得率为（6.18±0.05）%；响应曲面法的最佳提取率方案为压强26.75 MPa，温度50 ℃、时间3 h、流速2.61 mL/min，预期的总黄酮得率为6.20%，验证试验的总黄酮得率为（6.21±0.05）%。结果表明，响应曲面法及正交试验法优化工艺后所得的总黄酮萃取率分别为（6.21±005）%、（6.18±0.05）%，可以看出响应曲面法优化所得条件的黄酮萃取率大于正交试验法，但是不显著；正交试验只能得到总黄酮萃取中各因素不同水平之间的最优组合，不能考察到组合外的情况；响应曲面法通过构建二次回归模型，不仅可以得到各因素对黄酮得率的影响大小及显著性，还能找出试验设置水平之外的最优萃取工艺，且最优萃取工艺的总黄酮提取率要优于正交试验法，但是两者的差距并不明显。

关键词：桑叶；超临界萃取技术；总黄酮得率；响应曲面法；正交试验法

中图分类号： R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0189-05

收稿日期：2017-03-03

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（编号：81402030）。

作者简介：缪伟伟（1988—），女，江苏盐城人，硕士，助理工程师，研究方向为生物工程。E-mail：miaoww@sumhs.edu.cn。

通信作者：王志雄，博士，副教授，研究方向为生物工程。E-mail：wangzx@sumhs.edu.cn。 桑叶是我国传统中药之一，为桑属植物桑树（Morus alba L.）的叶片，曾被记载于《神农本草经》中，中医又称神仙草、铁扇子。桑叶性甘、寒，甘可以益血，寒可以凉血，甘寒相合，故下气而益阴，主治风热感冒、肺热燥咳、头晕头疼、目赤昏花等症[1-4]。研究发现，桑叶中含有多种功能性成分，如矿物质、维生素、食物纤维、氨基酸、植物甾醇、黄酮类、生物碱类、多糖等。其中黄酮类化合物具有显著的抗癌、抗氧化作用，受到人们的广泛关注，其抗肿瘤作用主要表现在抗癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡和增强抑癌基因活性及抑制癌基因表达等方面[5-7]。超临界二氧化碳流体（supercritical CO2 fluid extraction，简称SFE-CO2）萃取方法是一种新兴技术，目前在国际上属于最先进的物理萃取分离技术，萃取方法主要利用高渗透性和高溶解能力来提取分离成分，用到的溶剂是二氧化碳，以二氧化碳为溶剂，与一般的液体溶剂萃取相比，超临界二氧化碳萃取在速度和范围上更占优势[8-10]。综上所述，本研究运用响应曲面法分析超临界萃取中桑叶总黄酮提取的关键因素，并获得其最佳提取条件，能为进一步开发和利用桑叶中的总黄酮成分提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料、药品 桑叶干粉（日本野姬和株式会社），芸香苷标准品（上海金穗生物公司），无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠（上海金穗生物公司），氢氧化钠（上海沃凯化学试剂有限公司），均为国产分析纯。

1.1.2 器材 容量瓶，量筒，移液枪，离心管，过滤器，漏斗，滤纸，石英比色杯等。紫外可见光分光光度计（756P，上海光谱仪器有限公司），超临界二氧化碳流体萃取设备（美国Waters公司），恒温水浴箱（CV-420，上海恒一精密仪器有限公司），超纯水系统（RE-100，上海本昂科学仪器有限公司），电子天平（FA2104，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺路线 称取干燥后的桑叶粉2 g，装入超临界萃取装置的萃取釜中，以无水乙醇为夹带剂。在本试验中通过改变相关萃取参数，完成相关萃取，获得总黄酮提取液，计算得总黄酮提取率。具体步骤如下：

桑叶→干燥→称量→超临界萃取→总黄酮提取液→测定总黄酮提取率

1.2.2 标准曲线的绘制 精确称取干燥至恒质量的芸香苷标准品5.0 mg，用无水乙醇超声溶解，摇匀，定容至50 mL，使之成为浓度100 μg/mL芸香苷标准品溶液。精确量取上述溶液0、1、2、3、4、5 mL，加5%亚硝酸钠水溶液0.3 mL，放置 6 min，加10%硝酸铝0.3 mL，混匀后放置6 min，加入1%氢氧化钠溶液4 mL，混匀，放置15 min后，加无水乙醇定容至10 mL，静置15 min，等待显色后用紫外-可见分光光度计在510 nm波长处测吸光度。以芸香苷标准品浓度为横坐标、510 nm处的吸光度为纵坐标作图，绘制标准曲线（图1）。

1.2.3 总黄酮提取率数理公式 量取1 mL桑叶提取液， 按

绘制芸香苷标准曲线的步骤显色，于510 nm波长处测定吸光度，计算提取液中总黄酮的浓度，再根据以下公式，得到总黄酮提取率：

总黄酮提取率=C×Vm×100%。

式中：C表示提取液总黄酮的浓度（mg/mL）；V表示提取液定容后的体积（mL）；m表示称取的样品桑叶干粉的质量（mg）。

1.2.4 单因素试验 根据文献[8-10]可得，影响总黄酮得率的主要因素有萃取温度、萃取压强、萃取时间和夹带剂流速。本研究中采用这4个因素进行单因素试验，分别考察各因素对桑叶总黄酮得率的影响，具体见表1。

1.2.5 正交试验设计 以单因素试验为基础，建立4因素3水平的正交试验，分析上述因素对总黄酮得率的影响，设计见表2。endprint

1.2.6 响应曲面试验设计 依据最佳单因素条件，根据 Box-Behnken 中心组合试验设计原理采用4因素3水平的响应曲面法对桑叶提取总黄酮工艺条件进行分析和优化。具体因素编码及因素水平见表3。

1.2.7 试验数据分析 通过SPSS 19.0软件进行统计分析处理，通过Design Expert 8.0.6软件进行响应曲面试验的设计和统计分析，采用Sigmaplot10.0和Excel 2007作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

根据表1中的单因素试验设计所得结果见图2。萃取温度45 ℃、萃取时间2.5 h、夹带剂流速2.5 mL/min、萃取压强25 MPa为各单因素的最大响应值。在正交试验及响应曲面法试验中以此为基础，设计因素水平，进行提取工艺的优化。

2.2 正交试验结果

由表4可以看出，对总黄酮得率影响的大小顺序为C>A>D>B，即萃取时间>萃取压强>夹带剂无水乙醇流速>萃取温度。其中萃取时间对总黄酮得率的影响最大，其次是萃取压强，并且萃取的最优化组合为A2B1C3D2，即最优工艺为萃取压强25 MPa，萃取温度40 ℃，萃取时间3.0 h，夹带剂无水乙醇流速2.5 mL/min，在此条件下进行验证试验，黄酮得率为（6.18±0.05）%。

2.3 響应曲面试验结果

2.3.1 黄酮得率条件拟合 根据前期试验分析，选取萃取时间、萃取压强、夹带剂无水乙醇流速、萃取温度这4个因素，运用Design-Expert 8.0.6.0 软件设计3个水平因子试验，筛选显著因素；通过爬坡试验逼近最大响应区；然后运用Design-Expert 8.0.6.0软件设计中心组合试验，建立提取模型，预测最佳提取条件和黄酮得率。因素编码及水平见表3。

由表6可知，萃取压强、萃取时间对黄酮得率影响极显著（P<0.01），萃取温度对黄酮得率影响显著（P萃取压强>萃取温度>夹带剂无水乙醇流速。

2.3.2 拟合模型的建立 从图3-a、图3-b可知，试验模型的各残差分布结果基本都表明，经方法分析对总黄酮得率建立的试验模型基本在同一条直线上，与失拟分析相一致。从模型分析显著性可以看出，该试验模型各残差点在“0”点直线两侧不均匀分布，证明这2个模型的建立具有可靠性。失拟项P=0.427 3>0.05，不显著，纯误差值为0.000 45，数值比较小。相关数据分析表明，该试验模型的拟合程度较好，试验误差较小。失拟项反映拟合函数与离散点之间的关系，分析其结果值，极不明显，对分析本模型具有重要作用。

模型方程回归系数及显著性检验结果见表6。可以看出，模型一次项A、B、C显著或极显著，D不显著；二次项AC、A2、C2、D2显著或极显著；其余各项不显著。因此可知，各个具体试验因素与响应值都不是线性关系。

通过软件对试验模型进行分析，并且采用Y作为因变量，采用R1为总黄酮提取量，A、B、C、D分别代表萃取压强、萃取温度、萃取时间、夹带剂流速。得到回归方程如下：

R1=5.95+0.068×A+0.024×B+0.14×C+5.833×10-3×D+0.020×A×B-0.042×A×C-0.020×A×D+0.000×B×C+0.018×B×D+0.010×C×D-0.059×A2+

6.250×10-3×B2+0.076×C2-0.059×D2。

2.3.3 响应曲面结果分析 通过模型方程所作的响应曲面及等高线结果见图4至图9，萃取时间对总黄酮得率的影响最明显，其次是萃取压强，并且各个因素之间的交互作用并不明显。根据图4至图9及表5、表6中的试验结果分析，采用CO2超临界技术萃取桑叶中的黄酮类物质，萃取时间和萃取压强是需要考虑的重要因素[9，11-13]，提高萃取时间和萃取压强虽然有利于活性物质从植物细胞中释放出来，但是超过最适值之后，则有可能导致一些压敏、热敏感的黄酮物质在提取过程中发生分解或异构化反应[13]。目前已经有研究表明，在高温高压条件下总黄酮中部分物质的异构化进程大大加快[14]。萃取时间也是影响黃酮提取率的一个重要因素，在一定的萃取温度、萃取压强下，试验总黄酮提取率随着萃取时间的延长而提高，但延长萃取时间会增加夹带剂的消耗，同时仪器损耗增加，故设定萃取时间需要综合考虑，以获得更好的经济效应。相比其他参数而言，夹带剂流速对总黄酮得率影响最不显著（P=0.578 2），故在实际生产中，可以适当降低夹带剂流速，降低生产成本。

2.3.4 最优提取条件的选择 根据Design-Expert8.0.5软件可以优化最佳方案，最佳提取率方案为压强26.75 MPa，温度50 ℃，时间3 h，流速2.61 mL/min，预期的总黄酮得率为6.20%。根据试验结果，进行3组平行试验，得到总黄酮得率为（6.21±0.05）%，试验结果与Design-Expert8.0.5软件优化的理论预测值比较误差约为2.00%，可以证明采用响应曲面法优化得到的提取条件参数基本准确可靠，具有一定的实用价值。

2.4 响应曲面分析与正交试验验证比较

响应曲面法、正交试验法优化工艺后所得的黄酮萃取率分别是（6.21±0.05）%、（6.18±0.05）%，可以看出响应曲

面法优化所得条件的黄酮萃取率大于正交试验法，但是不显著。正交试验只能得到总黄酮萃取中各因素不同水平之间的最优组合，不能考察到组合外的情况，信息量少，而且未能体现各因素对总黄酮得率是否有显著性影响。而响应曲面法对数据的分析比较详细，不仅可以知道各因素对黄酮得率的影响大小，而且可以知道各因素是否对黄酮得率有显著性影响。因此，响应曲面法与正交试验法相比，在各因素对黄酮得率影响程度及显著性的分析上优于正交试验。endprint

3 结论与讨论

传统上萃取桑叶中总黄酮的方法主要有回流提取法、超声提取法、微波提取法、索氏提取法等。但上述方法存在温度相对较高、总黄酮提取率相对较低、萃余物质存在大量的溶剂残余等缺陷。相比而言，超临界CO2萃取方法能够在较低温度条件下实现桑叶中总黄酮物质的高效提取，萃取液中能够保留多种具有生理活性的总黄酮成分，萃余物无有机溶剂残留，流程简单，操作相对简单，可保护桑叶总黄酮中热敏性物质不受破坏等特点，能够很好地解决上述工艺缺陷[14-16]。

响应曲面法与正交试验法都是优化有效成分提取工艺的最常用方法。正交试验只能找到各因素不同水平之间的最优组合，不能考察不同水平组合之外的情况；而响应曲面法通过构建二次回归模型，能找出试验设置水平之外的最佳水平组合，还可以得到各因素对总黄酮得率的影响大小及显著性。根据响应曲面法对提取影响因素的分析，确定最优工艺为萃取压强 26.75 MPa，萃取温度50 ℃，萃取时间3 h，夹带剂流速2.61 mL/min，总黄酮预期提取率可达6.20%，验证试验的总黄酮得率是（6.21±0.05）%。可见响应曲面法对桑叶的提取工艺进行优化，不仅科学合理、准确可靠，而且快速可行，该方法对工艺方面的研究具有一定的意义。

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