矮壮素对鼓粒期大豆铬亚细胞分布的影响

李艳+冷燕+韦俊位+彭伟+杨远祥+刘飞

摘要：为研究植物外源激素对植物抗重金属特性的影响，以日本青、韩国三青豆2个大豆品种为材料，通过用不同浓度（0、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 g/L）的矮壮素进行浸种处理，研究铬污染土上大豆鼓粒期根、茎、叶、籽粒各器官亚细胞组分（细胞壁、细胞器、细胞可溶性组分）中的铬含量。结果表明，从大豆各器官亚细胞组分中的铬积累及分布比例来看，矮壮素浸种可以提高2个品种各器官细胞壁中铬的积累量，但最适矮壮素处理浓度在2个品种间存在差异。

关键词：矮壮素；大豆；铬；亚细胞分布

中图分类号： S565.101文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0077-04

通信作者：冷燕，硕士，主要从事作物抗逆性研究。E-mail：705784903@qq.com。目前，由于工业生产排放大量重金属，使土壤、水受到较大污染，已危害作物生长。铬（Cr）等重金属会严重伤害作物根系，影响作物叶片对于重要营养元素铁的吸收，从而降低作物光合速率和蒸腾速率，严重时甚至造成作物死亡[1-2]。植物在重金属环境中能正常生存，主要是因为重金属在植物体内以不具有生物活性的解毒形态存在，如结合到细胞壁中、主动运输进入液泡、与有机酸或某些蛋白质络合等[3]，且重金属在细胞壁的沉淀以及液泡的区域化分布是植物内部解毒的2个重要途径[4]。

植物激素对植物的抗逆性有一定调节作用。Khan等发现，IAA能减少HgCl2对丝瓜（Luffa cylindrical L.）基茎生长的抑制作用[5]；研究还表明，IAA在盐胁迫和重金属胁迫下能够促进植株根系和茎的生长[6-8]。Agami等在对镉（Cd）胁迫下小麦叶片抗氧化性的研究中指出，吲哚乙酸和水杨酸减轻了镉诱导的氧化损伤，提高了叶片对镉的耐受性并且增强了叶片结构[9]。Zhu等研究发现，赤霉素在拟南芥中对镉毒性的缓解作用主要是通过减少与镉积累相关的NO的积累以及降低与Cd2+摄取相关的IRT1的表达[10]。但有关植物激素对大豆抗铬污染的研究尚鲜有报道。矮壮素作为一种重要的生长调节剂，能有效地影响脱落酸含量，使之在营养生长期和生殖生长期分别增加和降低，从而提高地榆的抗逆性[11]。在高羊茅的研究中也发现，矮壮素能使高羊茅叶片内源激素生长素、赤霉素含量一直呈下降趋势，脱落酸含量呈上升趋势[12]。在重金属胁迫下，矮壮素能否使植物的抗逆性提高还有待进一步研究。本研究通过对矮壮素浸种后的大豆（Glycine max）进行铬胁迫处理，旨在探讨矮壮素在大豆抗重金属胁迫中的作用。

1材料与方法

1.1试验地概况及材料

本试验于2011年在四川农业大学新区农场进行，供试土壤为紫色土，其基本理化性质为铬含量76.75 mg/kg，有机质含量22.3 g/kg，全氮含量1.45 g/kg，全磷含量0.57 g/kg，全钾含量12.21 g/kg，pH值7.46。

供试材料为在成都平原种植面积广且品种优良的2个大豆（Glycine max）品种日本青和韩国三青豆。日本青分枝3～5个，株高约50 cm，成熟期100 d左右；韩国三青豆株高约 50 cm，成熟期90 d左右。

1.2试验设计与方法

用32.5 cm×25 cm的塑料盆装入风干土5 kg，按GB 15618—1995《土壤环境质量标准》加入CrCl3·H2O溶液，充分混匀（淹水浸没）放置2周后装盆，調配土壤铬污染水平达GB 15618—1995《土壤环境质量标准》（200 mg/kg）。

选择籽粒饱满、大小均匀2个大豆品种（日本青和韩国三青豆）的种子，采用矮壮素浸种处理，设置5个处理浓度与对照（0、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 g/L），每个处理重复5次[13]。具体浸种处理如下：

在室温下，用5%（V/V）NaClO浸泡大豆种子3 min，经去离子水清洗4次后，按照设定的矮壮素浓度浸种（保持完全淹没）6 h，然后转移至铺有2层湿润滤纸的培养皿中催芽 24 h，选取长势一致的6株苗播入预先处理过的土壤中；对照（CK）用去离子水浸种。在幼苗长至2叶1心时，保留长势一致的幼苗4株/盆。

1.3测定项目及方法

1.3.1根、茎、叶、籽粒铬亚细胞分布亚细胞组分的分离：参照Weigel等的方法，采用差速离心法分离出不同的细胞组分[14]。准确称取鲜样2 g于石英研钵中，加入20 mL提取液[0.25 mmol/L蔗糖+50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值 7.8）+1.0 mmol/L二硫赤鲜糖醇]，研磨匀浆，匀浆液在冷冻离心机中于3 000 r/min下离心（叶、籽粒的离心时间为 15 min，根、茎为30 min），沉淀为细胞壁，上清液在 26 000 r/min 下离心30 min，沉淀为细胞器；上清液为细胞可溶性组分。全部操作在4 ℃下进行，并在相同条件下测定铬全量以计算回收率。细胞壁和细胞器组分采用硝酸-高氯酸湿化消化，细胞可溶性部分铬含量直接上机测定，并以提取液作空白对照，用Aaanlust 800型原子吸收分光光度计进行测定[15]，并在相同条件下测定铬全量以计算回收率。

1.3.2数据处理方法用DPS进行方差分析和多重比较。

2结果与分析

2.1矮壮素对鼓粒期大豆根铬的亚细胞分布的影响

2.1.1日本青根中铬的亚细胞分布由表1可知，从根各细胞组分的铬含量来看，与CK相比，1.00、1.50 g/L矮壮素浸种提高了日本青根细胞壁铬含量，而0.50、0.75 g/L矮壮素浸种极显著降低了日本青根细胞壁铬含量，其中0.50 g/L处理降低幅度最大，为18.17%，达到极显著差异水平（P<0.01）；矮壮素浸种降低了根细胞器铬含量，但整体上随矮壮素浓度的升高铬含量降低的程度减小，0.50 g/L处理铬含量降低幅度最大，为33.83%，达到极显著差异水平（P<0.01）；根细胞可溶性组分中的铬含量在矮壮素浸种处理后均降低，其中 2.00 g/L 处理降低幅度最大，为36.51%，达到极显著差异水平（P<0.01）。

从根各细胞组分中铬的积累分配比例来看，矮壮素浸种提高了根细胞壁中铬的积累分配比例，并降低了根细胞器中铬的积累分配比例，在0.75 g/L处理时，细胞壁中铬比例最大，为74.56%，较CK增加4.93百分点，但细胞器中铬的积累比例最小，为 21.93%，较CK减少4.35百分点；根细胞可溶性组分中铬的积累在0.50 g/L矮壮素浸种处理后升高，但在其他处理浓度下均降低，在2.00 g/L处理下最低，为289%，较CK减少1.20百分点。

2.1.2韩国三青豆根中铬的亚细胞分布由表1可知，从根各细胞组分的铬含量来看，与CK相比，0.50、0.75 g/L矮壮素浸种极显著降低了韩国三青豆根细胞壁铬含量，降低幅度分别为21.59%、11.20%；其他浓度处理对根细胞壁铬浓度的影响未达极显著水平；矮壮素浸种降低了根细胞器、根细胞可溶性组分铬含量，均在2.00 g/L处理降低幅度最大，分别降低了27.10%、14.68%，达到极显著差异水平（P<0.01）。

从根各细胞组分中铬的积累分配比例来看，随着矮壮素浸种浓度的升高，根细胞壁中铬的积累分配比例提高，在200 g/L处理提高幅度最大，为3.96百分点；根细胞器中铬的积累分配比例随矮壮素浓度的升高降低，在2.00 g/L处理下出现最小值，降低了3.30百分点；根细胞可溶性组分中铬的积累分配比例在低矮壮素浓度下即0.50、0.75 g/L处理下升高，而在2.00 g/L处理下降低。

2.2矮壮素对鼓粒期大豆茎铬的亚细胞分布的影响

2.2.1日本青茎中铬的亚细胞分布由表2可知，与CK相比，1.50 g/L矮壮素浸种极显著提高了日本青茎细胞壁铬含量；0.50、0.75 g/L处理极显著降低了铬在细胞壁中的含量，并且在0.50 g/L处理下降低幅度最大，达到32.34%；矮壮素浸种显著降低了日本青茎细胞器铬含量，其中1.00、2.00 g/L处理降低了44.37%，降低幅度最大；矮壮素浸种提高了茎细胞可溶性组分中铬的含量，在1.00、1.50、2.00 g/L处理下铬含量相同且最大，为0.19 mg/kg，较CK极显著（P<0.01）提高了18.75%。从茎各细胞组分中铬的积累分配比例来看，矮壮素浸种提高了茎细胞壁和细胞可溶性组分中铬的积累分配比例，降低了茎细胞器中铬的积累分配比例。

2.2.2韩国三青豆茎中铬的亚细胞分布由表2可知，与CK相比，1.50 g/L矮壮素浸种极显著提高了莖细胞壁铬含量，提高幅度达到7.95%，其他浓度处理极显著降低了铬在细胞壁中的积累，其中在0.50 g/L处理降低幅度最大，为 32.41%；矮壮素浸种降低了铬在茎细胞器中的积累，其中 0.75 g/L 处理降低幅度最大，为42.57%；与对照相比，0.50、0.75 g/L处理极显著提高了茎细胞可溶性组分中的铬含量，并且在0.50 g/L处理下升高幅度最大，为30.43%，而 1.00 g/L 处理极显著降低了茎细胞可溶性部分铬含量。

从茎各细胞组分中铬的积累分配比例来看，0.50、2.00 g/L 矮壮素浸种降低了茎细胞壁中铬的积累分配比例，而其他处理浓度表现为升高趋势；矮壮素浸种降低了细胞器中铬的积累分配比例；1.50 g/L矮壮素浸种降低了茎可溶性部分铬的积累分配比例，而其他处理表现为升高趋势。

2.3矮壮素对鼓粒期大豆叶铬的亚细胞分布的影响

2.3.1日本青叶中铬的亚细胞分布由表3可知，与CK相比，除1.50 g/L浓度外，其他浓度矮壮素处理降低了叶片细胞壁中铬积累量，在0.75 g/L出现最小值，降低了19.80%，达到极显著差异（P<0.01）；矮壮素浸种处理降低了叶细胞器铬含量，并且在0.75g/L处理出现最小值，降低幅度为表2矮壮素浸种对鼓粒期大豆茎从叶各细胞组分中铬的积累分配比例来看，矮壮素浸种提高了叶细胞壁（除2.00 g/L处理外）和细胞可溶性组分中铬的积累分配比例，且铬积累分配比例均呈先升高后降低的趋势，分别在0.75、1.00 g/L 处理处出现最大值，降低了叶细胞器中铬的积累分配比例，在0.75 g/L处理处出现最小值。

2.3.2韩国三青豆叶中铬的亚细胞分布由表3可知，与CK相比，在0.50 g/L处理下矮壮素浸种极显著降低了叶细胞壁中的铬含量，降低幅度为14.78%；其他浓度处理下叶片细胞壁中铬含量有下降趋势，但未达到极显著水平；叶片细胞器中铬含量在矮壮素浸种处理后极显著降低，并且在 0.50 g/L 处理下降低幅度最大，为14.39%；矮壮素浸种提高了叶细胞可溶性部分铬含量，且随处理浓度的上升呈先升高后降低的趋势，在0.75 g/L处理处出现最大值，提高幅度最大，为54.55%。

从叶各细胞组分中铬的积累分配比例来看，0.50、0.75 g/L 矮壮素浸种降低了叶细胞壁铬的积累分配比例，而其他浓度处理表现为升高趋势，且积累分配比例随浓度的升高而提高。矮壮素浸种降低了叶细胞器中铬的积累分配比例，提高了叶可溶性组分中铬的积累分配比例。

2.4矮壮素对鼓粒期大豆籽粒铬的亚细胞分布的影响

2.4.1日本青籽粒中铬的亚细胞分布由表4可知，与CK相比，矮壮素浸种对籽粒细胞壁铬含量基本无显著影响，但极显著降低了籽粒细胞器和细胞可溶性组分（除2.00 g/L处理外）铬含量，分别在0.75、1.00 g/L处理时出现最小值，降低幅度分别为2090%、36.36%；从籽粒各细胞组分中铬的积累分配比例来看，矮壮素浸种提高了籽粒细胞壁铬的积累分配比例，且积累分配比例随处理浓度的增大呈先升高后降低的趋势，降低了籽粒细胞器中铬的积累分配比例，2.00 g/L处理提高了籽粒细胞可溶性组分铬的积累分配比例，其他浓度处理则呈降低趋势。

2.4.2韩国三青豆籽粒中铬的亚细胞分布由表4可知，与CK相比，韩国三青豆经矮壮素浸种后，籽粒细胞壁中铬含量无显著变化，但矮壮素处理极显著降低了籽粒细胞器中铬含量，并且在0.75 g/L处理下降低幅度最大，为21.88%；2.00 g/L 处理极显著提高了籽粒细胞可溶性部分铬含量，提高幅度10%，而其他浓度处理降低了可溶性部分铬含量，在1.00 g/L处理下降低了40%，达到极显著差异（P<0.01）。

从籽粒各细胞组分中铬的积累分配比例来看，矮壮素浸种提高了韩国三青豆籽粒细胞壁铬的积累分配比例，且积累分配比例随处理浓度的增大呈先升高后降低的趋势，降低了籽粒细胞器中铬的积累分配比例，2.00 g/L处理提高了籽粒细胞可溶性部分铬的积累分配比例，其他浓度处理则呈降低趋势。

3讨论与结论

研究表明，土壤中的铬通过根表皮细胞进入皮层细胞，穿过凯氏带，在木质部进行装载后通过导管运往地上部分，这对表4矮壮素浸种对鼓粒期大豆籽粒铬的亚细胞分布的影响

已有研究表明，生长素和赤霉素通过促进了作物细胞分裂和延长，增加了作物根细胞与重金属的可接触面积，促进了作物对重金属的吸收[19-20]。本研究发现，低浓度（0.50、0.75 g/L）的矮壮素浸种处理对减少日本青根系对铬的吸收作用最大，并且铬在细胞壁中的分配比例最大（0.75 g/L处理下）；随着矮壮素处理浓度的增加，各浓度相比较，铬在细胞壁中的分配有减少趋势而在细胞器中的分配有增加趋势。韩国三青豆在较高浓度（1.00、1.50、2.00 g/L）矮壮素处理下根系细胞壁中的铬含量增加，并且细胞器中的铬减少幅度也更大，从分配比例看，高浓度下铬在细胞壁中的分配更多而在细胞器中更少。因此，不同大豆品种对矮壮素浸种浓度的反应不同，低浓度的矮壮素浸种更适于日本青根系细胞壁对重金属的吸附而韩国三青豆在高浓度矮壮素处理后根系抵御重金属能力会提高。

日本青中浸种处理在较低浓度即叶片和根在0.75 g/L、茎在 1.00 g/L浓度下分别在叶片和根、茎细胞壁中分配更多的铬，更利于抗逆；而韩国三青豆则在较高浓度（茎 1.50 g/L，根、叶2.00 g/L）浸种处理后更利于重金属在各器官细胞壁的富集，区划重金属能力更好。浸种处理对籽粒中铬在各部位的分布无显著影响。因此，不同品种、不同矮壮素处理浓度对铬的分配影响不同，并且从根系到籽粒，大豆根吸收重金属后，通过茎中导管、筛管向其叶和籽粒运输，茎对重金属的积累与茎的运输能力密切相关[21-22]，茎运输能力低的作物品种可以有效降低籽粒重金属的含量，因此籽粒中重金属含量主要取决于运输过程，而矮壮素浸种处理对籽粒中的重金属含量影响不大。

从大豆籽粒铬的亚细胞分布来看，浸种处理提高了籽粒细胞壁中铬积累比例，这可能是因为大豆籽粒细胞壁的主要成分為蛋白质、木质素、纤维素、半纤维素和果胶质等，使细胞壁表面带有较多的羧酸基团和少量带正电荷的氨基[18]，铬可通过静电引力吸附在细胞壁上，进而减少铬的跨膜运输，减少对细胞器的伤害。另外，前人的研究结果表明，外源激素浸种能提高大豆成熟期籽粒产量[23-25]，因为矮壮素能够调控大豆的营养生长，促进其生殖生长，促进花芽分化，使作物花数增多，同时提高植物抗逆性和光合作用，促进光合产物的形成[26-27]，从而提高大豆的产量；但若喷施矮壮素浓度过高，则可能会对叶片造成伤害，降低光合速率，进而使籽粒产量有所降低。因此，外源矮壮素也能通过影响籽粒抗重金属能力和生长来影响作物产量。

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