白薇提取物的抗氧化和抑菌活性

彭旋+陈楚英+陈金印+万春鹏

摘要：分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和蒸馏水提取白薇粉末，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基法、铁离子还原能力（FRAP）测定法研究其抗氧化活性；通过杯碟法测定不同溶剂提取物对意大利青霉的抑菌效果；用生长速率法研究白薇乙醇提取物对其他15种植物病原菌的抑菌活性。抗氧化试验表明：白薇粉末蒸馏水、丙酮、乙醇提取物的抗氧化活性较好，其清除DPPH自由基的IC50分别为15.66、25.37、28.27 mg/mL，其总酚含量分别为70.19、63.20、53.84 mg/g，可见抗氧化活性与总酚含量密切相关。抑菌活性试验表明：白薇粉末乙酸乙酯、丙酮、乙醇乙醇提取物对意大利青霉有抑菌活性，且乙醇提取物抑菌圈直径最大，为31.50 mm；乙醇提取物对其他15种植物病原菌均有一定的抑菌活性，其中对枣拟茎点霉、辣椒疫霉菌、西瓜尖镰孢菌活性最强，EC50分別为0.194、1.019、4.185 mg/mL。研究结果表明，白薇乙醇提取物具有较好的抗氧化活性和较强的抑菌活性，可用于植物源保鲜剂的开发。

关键词：白薇；抗氧化；总酚；总黄酮；抑菌活性

中图分类号：R285；TS255.3文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2017）04-0140-04

白薇（Cynanchum atratum）为萝摩科（Asclepiadacea）鹅绒藤属（Cynanchum）植物直立白薇（Cynanchum atratum Bunge）或蔓生白薇（Cynanchum versicolor Bunge）的干燥根及根茎，在全国大部分地区均有分布，主要生长于山地。据《中药大辞典》记载，白薇根及根茎部分可供药用，有“清热散肿、利尿通淋、解毒疗疮”的功效。目前，国内外对白薇的研究主要集中在化学成分的分离鉴定与药理作用。化学成分研究表明，白薇主要含有C21甾体皂苷、白薇素、挥发油、强心苷，而且发现白薇皂苷具有抗菌消炎作用[1]。

柑橘是我国南方的主要水果品种之一，在采后贮藏过程中易受青绿霉菌侵染，导致果实腐烂，随后大量病果被到处丢弃，造成巨大的经济损失、环境污染。另外，受空气中的氧和果实中酶的作用，果实油脂中的不饱和脂肪酸会氧化分解为醛、酮和低级脂肪酸，降低果实的品质[2]。为了降低采后柑橘果实烂果率，目前生产上主要使用咪鲜胺、噻菌灵等化学杀菌剂，而使用化学杀菌剂易造成果实药剂残留，危害人体健康。面对这种情况，开发具有较强抗氧化性和能抑制柑橘等植物采后主要病害病原菌双重功能的保鲜剂是比较理想的办法。笔者所在课题组前期筛选发现，白薇对柑橘青霉菌具有较强的抑制作用。因此，本研究以石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水为提取溶剂，采用超声波辅助方法提取白薇，比较白薇不同溶剂提取物体外抗氧化性和对柑橘采后主要病原菌意大利青霉（Penicillium italicum）的抑菌活性；进一步研究白薇乙醇提取物对其他15种植物病原菌的抑菌活性，以期为植物源果蔬保鲜剂相关研究提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

白薇，购自江西省樟树市华丰药业有限公司，粉碎，过40目筛，常温保存备用。柑橘青霉病病菌：柑橘意大利青霉（P. italicum）；枣褐斑病病菌：枣拟茎点霉菌（Phomopsis mauritiana）；柑橘黑腐病病菌：柑橘链格孢菌（Alternaria citri）；柑橘蒂腐病病菌：柑橘囊孢壳菌（Phytophthora capsici）；莴苣菌核病病菌：莴苣菌核核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）；辣椒疫病病菌：辣椒疫霉（Phytophthora capsici）；柑橘酸腐病病菌：柑橘白地霉（Geotrichum citri-aurantii）；茄褐纹病病菌：茄褐纹拟茎点霉（Phomopsis vexans）；柑橘灰霉病病菌：柑橘灰霉菌（Botrytis cinerea）；芦笋茎枯病病菌：芦笋天门冬拟茎点霉（Phomopsis asparagi）；西瓜枯萎病病菌：西瓜尖镰孢菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）；柑橘绿霉病病菌：柑橘指状青霉（Penicillium digitatum）；猕猴桃软腐病三大致病菌：葡萄座腔菌（Botryosphaeria parva）、猕猴桃拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis fici）、猕猴桃拟茎点霉（Phomopsis sp.）。以上菌株均由江西农业大学农学院植物病理实验室提供；PDA培养基，笔者所在实验室自制。

1.2仪器与试剂

HH-6恒温数显水浴锅（常州国华电器有限公司）；5804R冷冻离心机（德国Eppendorf）；R-3旋转蒸发仪（瑞士BUI）；KQ-500B超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；MIR-254恒温培养箱（日本三洋电机公司）；LX-300冷却水循环机（北京长流科学仪器公司）；HS-1300U超净工作台（苏静集团苏州安泰空气技术有限公司）；UV-2450紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；AUY220电子分析天平（日本岛津公司）；FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），购自Sigma公司（美国）；没食子酸、芸香苷标准品，购自中国生物制品研究所（北京）；其他试剂为市售试剂，所有试剂均为分析纯产品。

1.3白薇提取物样品的制备

称取30 g备用药粉，共6份，分别加入1 L不同溶剂（石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、蒸馏水），超声波辅助提取2 h（40 kHz，25 ℃），抽滤，滤渣加1 L相同溶剂重复提取1次。将2次滤液合并，于40 ℃旋转蒸发浓缩，最后真空冷冻干燥，称质量，加适当体积的溶剂配成100 mg/mL提取物储备液，4 ℃保存备用。

1.4测定方法

1.4.1总酚含量的测定[3]精确称取0.5 g没食子酸，用乙醇溶解定容至100 mL，分别移取0、1、2、3、5、10 mL到100 mL容量瓶内，定容。从上述不同浓度的标准溶液中分别移取 0.1 mL 到10 mL容量瓶中，分别加入6 mL水，混合后加入 0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，混合；3 min后，加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至10 mL。将上述标准溶液于 20 ℃ 放置2 h后，在765 nm波长处测定吸光度D765 nm，以D765 nm为横坐标、没食子酸浓度为纵坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。吸取0.1 mL适宜浓度的提取物（使D765 nm落在标准曲线的范围内），按上述方法进行显色反应，按照回归方程计算提取物的总酚含量。

1.4.2总黄酮含量的测定[4]精確称取10.0 mg芸香苷标准品（120 ℃烘干至恒质量），用甲醇定容至50 mL，配成 0.2 mg/mL 芸香苷标准溶液。吸取芸香苷标准品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL容量瓶内，加入 2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液、1 mL pH值为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液，用甲醇定容，40 ℃水浴显色10 min，在421 nm处测定吸光度D421 nm，以D421 nm为横坐标、芸香苷浓度为纵坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。吸取1 mL适宜浓度的提取物（使D421 nm落在标准曲线的范围内），按上述芸香苷标准品显色方法进行显色反应，按照回归方程计算提取物的总黄酮含量。

1.4.3DPPH·抗氧化活性测定参考刘海英等的方法[5]测定白薇不同提取物清除DPPH·自由基能力。在3.0 mL 0.06 mmol/L DPPH·乙醇溶液中加入10 L不同浓度（1、3、5、7、9 mg/mL）样品提取物，混匀后避光反应30 min，测定 517 nm 处吸光度D517 nm（1）。按照下列公式计算各样品对 DPPH· 自由基的清除率：

DPPH·清除率={D517 nm（0）-[D517 nm（1）-D517 nm（s）]}/D517 nm（0）×100%。

式中：D517 nm（0）为对照吸光度（仅含DPPH·乙醇溶液）；D517 nm（s）为空白对照（蒸馏水）的吸光度（样品与无水乙醇用以消除样品本身颜色的影响）。

1.4.4铁离子还原能力（FRAP）测定参考姜洪芳等的方法[6]测定白薇不同提取物还原力。吸取0.5 mL不同浓度（1、3、5、7、9 mg/mL）提取物于试管中，依次加入0.5 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH值6.6）、0.5 mL 1%铁氰化钾溶液，于50 ℃水浴保温20 min，快速冷却，再加入0.5 mL 10%三氯乙酸，于3 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液，再依次加0.8 mL蒸馏水、0.2 mL 0.1%三氯化铁溶液，充分混匀，静置10 min后，于700 nm处测吸光度D700 nm，用蒸馏水作参比。

1.4.5杯碟法抑菌活性测定用杯碟法测定白薇提取物对柑橘青霉菌抑菌活性[7]，用无菌水将活化好的意大利青霉菌洗入三角瓶中，过滤，将滤液充分摇匀制成孢子悬浮液，用血球计数板计数，使菌液孢子浓度为1亿CFU/mL。在无菌条件下，吸取1 mL意大利青霉菌悬液于融化的PDA培养基中，使菌液浓度在100万CFU/mL，摇匀后倒入平板。等培养基凝固后，吸取200 μL浓度为100 mg/mL的提取物于牛津杯中，进行抑菌活性的测定，重复3次。将平板放置于28 ℃恒温培养箱中培养2 d，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.4.6生长速率法抑菌活性测定测定白薇乙醇提取物对15种植物病原菌的抑菌活性[8]，在无菌环境下，采用二倍稀释法，用移液器吸取不同体积的白薇乙醇提取物加入到未凝固的PDA培养基中，制成含药培养基，其终浓度均为3.125～100.000 mg/mL，空白对照为纯PDA培养基（不加药剂）。葡萄座腔菌、枣拟茎点霉、莴苣菌核核盘菌、辣椒疫霉、猕猴桃拟盘多毛孢菌和西瓜尖镰孢菌用孔径4 mm的打孔器打取已活化的菌块边缘，其余菌种用孔径6 mm的打孔器打取活化好的菌块边缘。用接种针将菌块转接到不同浓度含药培养基及对照培养基中，每个浓度平行处理3次，将接种好的培养物放置在28 ℃恒温培养箱中培养4～7 d，随后用十字交叉法测量各培养皿菌落直径，计算平均值，记录各菌落生长情况。根据以下公式求出白薇乙醇提取物对各菌种的抑制率：

抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

以抑制率为因变量（y）、白薇乙醇提取物浓度的对数值为自变量（x），建立白薇乙醇提取物对15种植物病原菌的毒力回归方程：y=a+bln（x），求得方程的相关系数r、药剂EC50及其95%置信区间。

1.5数据分析

采用Excel 2003进行数据处理与作图，用SPSS 17.0进行Duncans多重比较数据统计分析。

2结果与分析

2.1白薇提取物总酚和总黄酮含量

根据总酚含量线性回归方程y=9.211 8x+0.061 2（r2=0.999 4）、总黄酮含量线性回归方程y=43.052x-0.515 1（r2=0.998 8），计算白薇不同溶剂提取物中的总酚、总黄酮含量。从表1可以看出，白薇不同溶剂提取物的总酚、总黄酮含量存在显著差异，其中总酚含量从高到低的提取溶剂依次是蒸馏水、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和石油醚提取物，分别为70.19、63.20、53.84、30.16、22.98、12.95 mg/g；三氯甲烷提取物的总黄酮含量最高，为51.14 mg/g，其次是乙酸乙酯、丙酮、乙醇和石油醚提取物，总黄酮含量在26.34～3320 mg/g之间，蒸馏水提取物的总黄酮含量最低，为 2.47 mg/g。

母表示差异显著（P<0.05）；表3同。[HT][FK）]

2.2白薇提取物的抗氧化活性

DPPH自由基是一类含有3个苯环的稳定紫色自由基，在517 nm处有强吸收，在DPPH醇溶液中加入抗氧化剂，会清除自由基，从而使紫色溶液变淡，且抗氧化剂的抗氧化能力越强，溶液越淡。因此，常用DPPH自由基清除法来测定抗氧化剂的抗氧化能力[9]。通常用IC50表示抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力，IC50为DPPH自由基清除率为50%时的抗氧化剂浓度，IC50越低，抗氧化能力越强。从图1-A可以看出，各提取物清除DPPH自由基的能力随着其浓度的增加而增强，呈正相关。测定样品不同浓度对DPPH自由基的清除率，通过回归分析得出各自的IC50，从表2可以看出，各提取物都有一定的抗氧化能力，其中白薇水提物抗氧化能力最强，其次为丙酮、乙醇提取物，乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚提取物抗氧化能力较弱，可见抗氧化活性与总酚含量呈正相关。

当样品具有还原性时，会提供电子将Fe3+/铁氰化物还原成Fe2+/铁氰化物，Fe2+在700 nm处通过普鲁士蓝有特征光吸收，吸光度越大，表明其还原能力越强。图1-B表明，白薇提取物都具有较强还原力，且随着浓度升高，还原力越强，但在不同提取物之间，还原力的差异较大；在试验浓度范围内，白薇丙酮、乙醇和水提取物的还原能力明显强于三氯甲烷、石油醚提取物；乙酸乙酯提取物的还原能力强于三氯甲烷、石油醚提取物。

2.3抗氧化能力与总酚、总黄酮含量相关性分析

比较分析白薇提取物抗氧化能力（IC50）与其总酚含量之间的关系，发现抗氧化能力越强的提取物，其总酚含量也越高（表1、表2）。对白薇提取物IC50和总酚含量进行相关性分析，从图2-A可知，白薇提取物的总酚含量与IC50的线性回归方程为y=0.976 3x+84.048（r2=0.950 5），两者呈显著负相关，表明总酚含量越高，IC50越小，抗氧化能力越强，提示总酚可能是白薇提取物抗氧化能力的关键物质。另外，通过图2-B对总黄酮含量与IC50的相关性分析可知，两者无显著的相关性（r2=0.290 3）。

2.4抑菌活性

选用对柑橘意大利青霉抑菌直径最大的乙醇提取物，测定该提取物对其他15种植物病原菌的室内毒力。EC50是药剂对病原菌抑制作用强弱的直观反映，药剂对病原菌EC50越小，表明药剂对其抑制能力越强。毒力回归方程的斜率（b）越大，说明随着药剂浓度升高，其抑制能力增加得越快，病原菌对药剂浓度越敏感。从表4可见，白薇乙醇提取物对15种植物病原菌均表现出一定的抑制效果，其中乙醇提取物对枣拟茎点霉的毒力最强，EC50为0.194 mg/mL，对猕猴桃拟茎点霉的EC50为120.940 mg/mL，抑制效果最弱；对其他菌种EC50由小到大排序为辣椒疫霉、西瓜尖镰孢菌、柑橘意大利青霉、柑橘链格孢菌、柑橘指状青霉、芦笋天门冬拟茎点霉、柑橘灰霉菌、柑橘白地霉、柑橘囊孢壳菌、猕猴桃擬盘多毛孢菌、莴苣菌核核盘菌、葡萄座腔菌和茄褐纹拟茎点霉，EC50在1.019～45.313 mg/mL范围内。根据毒力回归方程的斜率（b）可知，柑橘指状青霉对白薇乙醇提取物最敏感，b=0.303。

3讨论与结论

多酚类、黄酮类成分对植物的抗氧化和抗菌有重要的作用。有研究发现，山柰酚、槲皮素和其他黄酮醇等种类的黄酮有抗菌、止痒和抗过敏作用[10]。本试验发现，白薇乙醇提取物具有较强抗氧化活性，并对一些植物病原菌具有较好的抑制效果。Katalinic等研究发现，样品清除DPPH自由基能力与其多酚类物质含量有很大关系[11]。本试验也证明，总酚含量越高的样品，其清除DPPH自由基能力越强，说明可以将总酚含量作为初步筛选抗氧化样品的判断依据。一种物质的还原能力在一定程度上可以反映其潜在的抗氧化能力。Yen等研究发现，一些植物提取物的抗氧化能力和还原能力是相关联的[12]。本试验结果表明，具有较强清除DPPH自由基能力的水、丙酮以及乙醇提取物，还原铁离子能力也较强。

白薇提取物对柑橘意大利青霉抑菌活性表明，白薇不同溶剂提取物对意大利青霉具有不同的抑制作用，其中以白薇乙醇提取物的抑菌直径最大。白薇乙醇提取物对15种植物病原菌室内毒力测定结果表明，白薇乙醇提取物对它们均有一定抑菌活性，说明白薇乙醇提取物中含有多种病原菌的抑菌活性成分，具有较广的抑菌谱，特别是白薇乙醇提取物对6种柑橘采后病菌均有较好的抑菌效果，这为用白薇开发成柑橘防腐保鲜剂提供了理论依据，有望将其开发成天然抗氧化剂和柑橘防腐保鲜剂，从而为白薇的综合利用提供了理论依据，同时也为得到天然、安全的抗氧化剂及抑菌单体提供了一种新的植物来源。白薇抗氧化与抑菌活性的开发利用具有良好的发展前景，其活性成分的分离鉴定与抗氧化及抑菌活性的构效关系还有待进一步研究。

参考文献：

[1]袁鹰，张卫东，柳润辉，等. 白薇的化学成分和药理研究进展[J]. 药学实践杂志，2007，25（1）：6-9.

[2]张燕平，王维华. 以紫苏为原料的天然抗氧化剂的研制[J]. 食品工业，2000（3）：26-28.

[3]Meda A，Lamien C E，Romito M，et al. Determination of the total phenolic，flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey，as well as their radical scavenging activity[J]. Food Chemistry，2005，91（3）：571-577.[HT][HJ]

[4]马陶陶，张群林，李俊，等. 三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨[J]. 时珍国医国药，2008，19（1）：54-56.

[5]劉海英，仇农学，姚瑞祺，等. 我国86种药食两用植物的抗氧化活性及其与总酚的相关性分析[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2009，37（2）：173-180.

[6]姜洪芳，石宝俊，程晶，等. 凤仙花不同部位乙醇提取物多酚、黄酮含量测定及抗氧化活性研究[J]. 中国野生植物资源，2014，33（6）：9-14.

[7]周梦娇，万春鹏，陈金印. 桂枝提取物抑菌活性研究[J]. 食品工业科技，2014，35（12）：96-98.

[8]熊宇，向妙莲，陈明，等. 10种杀菌剂对柑橘炭疽病菌的室内毒力测定[J]. 中国南方果树，2014，43（1）：44-45.

[9]Aaa M，Smetanska I，Ramadan M F，et al. Antioxidant potential of sesame （Sesamum indicum） cake extract in stabilization of sunflower and soybean oils[J]. Industrial Crops and Products，2011，34（1）：952-959.

[10]Lim Y，Kim I，Seo J. In vitro activity of kaempferol isolated from the Impatiens balsamina alone and in combination with erythromycin or clindamycin against Propionibacterium acnes[J]. Journal of Microbiology，2007，45（5）：473-477.

[11]Katalinic V，Milos M，Kulisic T，et al. Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols[J]. Food Chemistry，2006，94（4）：550-557.

[12]Yen G，Chen H，Peng H. Evaluation of the cytotoxicity，mutagenicity and antimutagenicity of emerging edible plants[J]. Food and Chemical Toxicology，2001，39（11）：1045-1053.