花生基因的克隆、序列分析与载体构建

王云云++孙全喜+王秀贞++唐月异++吴琪 张青云 曹广英 祁雪 张君 王传堂

摘要：脱落酸（ABA）在植物生长发育中起着重要的作用，9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因（NCED）是其合成途径中的关键基因。采用逆转录PCR（RT-PCR）技术在花生种子中克隆到其同源基因[WTBX][STBX]AhNCED1，预测该基因开放阅读框为1 806 bp，编码601个氨基酸，蛋白质的分子质量为66.8 ku，等电点为8.49。通过生物信息学分析表明，该基因含有2种跨膜区，但均不明显；由17个丝氨酸、8个苏氨酸、5个酪氨酸参与磷酸化过程；同源比较发现，该基因与来自拟南芥、柱花草等的NCED具有较高的同源性，进化分析表明该基因与柱花草NCED的亲缘关系最近。笔者成功构建了该基因的亚细胞定位载体[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP和超表达载体pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1，为进一步研究花生中[WTBX][STBX]AhNCED1基因的功能奠定了基础。

关键词：花生；[WTBX][STBX]AhNCED1基因；生物信息学；载体构建

中图分类号：Q782；S565.201文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2017）03-0020-04

收稿日期：2015-12-22

基金项目：国家花生产业技术体系（编号：CARS-14）；山东省农业科学院青年科研基金（编号：2016YQN17、2015YQN13）；山东省农业科学院重大科技成果培育计划（编号：2014CGPY09）。

作者简介：王云云（1989—），女，内蒙古乌兰察布人，硕士研究生，主要从事花生生物技术等研究，E-mail：13001661900@163.com；共同第一作者：孙全喜（1983—），男，山东章丘人，博士，副研究员，主要从事花生遗传改良等研究，E-mail：sunqx1983@163.com。

通信作者：王传堂，博士，研究员，主要从事花生分子育种等研究，E-mail：chinapeanut@126.com；张君，博士，教授，主要从事花生生物技术等研究，E-mail：zhangjun@jlau.edu.cn。

花生栽培种（Arachis hypogaea L.），别称落花生，是我国重要的油料和经济作物，在油料生产和国际贸易中占有举足轻重的地位。与油菜、芝麻、向日葵等油料作物相比，花生的单产、总产量和出口量均居首位[1]。

脱落酸（ABA）是以异戊二烯为基本单位的一种十五碳类倍半萜类植物激素，因能促进叶片脱落而得名[2]。ABA在植物生长发育中起着重要的作用，如促进器官脱落、促进种子成熟和休眠、抑制种子萌发等。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，简称NCED）是ABA生物合成途径中的关键酶。第1个NCED基因在玉米ABA缺失突变体vpl4中被克隆[3]，随后研究人员在其他植物，如番茄[4]、菜豆[5]、拟南芥[6]、柱花草[7]中克隆了NCED基因。豆类作物中pvNCED基因的表达能延缓种子的萌发[8]。马铃薯（Solanum tuberosum）中leNCED基因的过量表达能提高ABA的含量，同时增强种子休眠性[9]。陈静等通過荧光定量PCR分析表明，在休眠和无休眠种子吸涨萌发过程中，[WTBX][STBX]AhNCED2对于维持种子休眠发挥了积极作用[10]。

本研究在花生X-166种子中克隆到ABA合成途径中关键基因[WTBX][STBX]AhNCED1，用系统发育树分析与柱花草的亲缘关系。通过多种生物在线工具分析该基因的跨膜区。笔者拟构建该基因的亚细胞定位载体[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP和超表达载体pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1，为研究该基因的细胞定位情况和在花生种子休眠中的作用奠定基础。

1材料与方法

1.1植物材料、质粒及载体

本试验所用植物材料花生X-166[11]由山东省花生研究所提供；pCambia1390-eGFP，由山东省水稻研究所谢先芝研究员馈赠；植物表达载体pCambia2300EC（添加了35S启动子及Tnos终止子的pCambia2300载体），由山东农业大学亓宝秀教授馈赠。

1.2方法

1.2.1[WTBX][STBX]AhNCED1基因序列的获得及PCR扩增利用花生[WTBX][STBX]NCED1 mRNA序列（GenBank登录号：AJ574819.2），根据预测基因的开放阅读框（ORF），用DNAClub设计含酶切位点SacⅠ的引物F1、R1（表1）。花生种子RNA的提取，用ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）进行反转录，获得单链cDNA，利用PCR对该基因的开放阅读框进行扩增。其中PCR反应体系：10 μL 5×HF Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs Mix，2 μL引物F1，2 μL引物R1，0.6 μL二甲基亚砜（DMSO），0.2 μL高保真酶Phusion（New England Labs），1 μL模板，32.2 μL ddH2O。PCR反应程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，30次循环；72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收PCR产物。将回收产物与pEASY-Blunt simple载体（北京全式金生物技术有限公司）连接、热激法转化大肠杆菌DH5α（北京全式金生物技术有限公司），将阳性克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.2.2花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因的生物信息学分析利用DNAMAN序列分析软件构建系统发育树；利用ExPASy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质的分子量、等电点；利用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html）进行跨膜分析；利用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白质磷酸化位点和结构。

1.2.3用于亚细胞定位载体的改造以含绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pCambia1390-eGFP稀释物为模板，根据序列设计引物F2、R2（表1），将得到的片段连接到克隆载体pEASY-blunt simple上，得到质粒pEASY-GFP。参照质粒小提试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]说明步骤，提取pEASY-GFP、pCambia2300EC质粒。通过限制性内切酶KpnⅠ、SacⅠ分别对pEASY-GFP和植物表达载体pCambia2300EC进行酶切，回收目的片段、载体片段，用连接酶Solution Ⅰ[宝生物工程（大连）有限公司]于16 ℃过夜连接，热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单菌落进行PCR和酶切鉴定，获得带有GFP基因的载体pCambia2300EC-GFP。

1.2.4花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因亚细胞定位载体构建参照质粒小提试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]说明步骤，提取pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1、pCambia2300EC-GFP质粒，利用限制性内切酶SacⅠ对两者进行单酶切，对pCambia2300EC-GFP酶切时进行去磷酸化处理，回收目的片段、载体片段，使用连接酶Solution Ⅰ[宝生物工程（大连）有限公司]进行16 ℃过夜连接，用热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单菌落进行PCR和酶切鉴定，获得带有[WTBX][STBX]AhNCED1基因的亚细胞定位载体[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP。

1.2.5花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因超表达载体构建参照质粒小提试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]说明步骤，提取pCambia2300EC质粒。利用限制性内切酶SacⅠ对植物表达载体pCambia2300EC进行酶切，同时进行去磷酸化处理，回收载体片段，使用连接酶Solution Ⅰ[宝生物工程（大连）有限公司]将“1.2.4”节中回收的目的片段与该载体片段于16 ℃进行过夜连接，热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单菌落进行PCR和测序鉴定，获得带有[WTBX][STBX]AhNCED1的植物表达载体pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1。

2结果与分析

2.1花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因的克隆

以ORF两侧设计的引物F1、R1进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后得到约为1 800 bp的片段（图1），与预期结果一致。测序结果利用DNAMAN软件分析得到长度为 1 806 bp 的ORF，编码601个氨基酸。将该基因推导的氨基酸序列与[WTBX][STBX]AhNCED1（登录号：CAE00459.2）进行比对分析，两者的同源相似性为99%，证实该序列为花生NCED基因片段，名称为[WTBX][STBX]AhNCED1。将该基因的氨基酸序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上进行在线BLASTp分析，表明该氨基酸序列与其他植物的NCED氨基酸有较高的相似性，它与柱花草（Stylosanthes guianensis，AAY98512.2）的相似性为93%，与柠条锦鸡儿（Caragana korshinskii，ACU86971.1）的相似性为78%，与鹰嘴豆（Cicer arietinum，BAM72560.1）的相似性为74%，与豌豆（Pisum sativum，BAC10550.1）的相似性为74%，与拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP_193569.1）的相似性为63%。利用DNAMAN软件进行系统发育树分析，结果见图2。

2.2蛋白质性质预测

采用ExPASy ProtParam预测蛋白质性质，结果显示，AhNCED1蛋白的理论分子质量为66.8 ku，理论等电点为 8.49，分子式为C2985H4665N813O880S25，原子数为9 368个，带负电荷氨基酸（Asp+Glu）數69个，带正电荷氨基酸（Arg+Lys）数74个，脂溶系数为75.12，总平均亲水性（GRAVY）为-0.389。用TMpred工具预测蛋白的跨膜区和跨膜方向，结果表明，228至261位氨基酸处可能有1个由内向外的跨膜区，在225至256位氨基酸处可能有1个由外向内的跨膜区，这2种跨膜区均不明显（图3）。

2.3蛋白质结构的预测

利用NetPhos 2.0 Server在线工具预测磷酸化位点，结果表明有17个丝氨酸（serine，简称S）、8个苏氨酸（threonine，简称T）、5个酪氨酸（tyrosine，简称Y）参与磷酸化过程（图4）。用SWISS-MODEL预测蛋白质三级结构（图5），结果显示，AhNCEDI蛋白的Qmean 4为-4.06。

2.4[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP载体构建

[CM（24]以含GFP的质粒稀释物为模板，通过PCR扩增获得约[CM）]

[TPWYY4.tif][FK）]

[FK（W12][TPWYY5.tif][FK）]

760 bp的片段。将带有GFP的克隆载体pEASY-GFP与植物表达载体pCambia2300EC同时用限制性内切酶KpnⅠ、SacⅠ进行双酶切，回收目的片段和载体，并进行连接转化、菌落PCR鉴定（图6）。挑选阳性克隆进行测序，同时进行酶切验证，结果表明，pCambia2300EC-GFP载体构建成功。将带[JP3]有[WTBX][STBX]AhNCED1的克隆载体pEASY-[JP][WTBX][STBX]AhNCED1、pCambia2300EC-GFP载体同时用SacI进行单酶切，结果见图7。回收载体片段与目的片段，连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆测序，序列分析表明[WTBX][STBX]AhNCED1基因已插入到pCambia2300EC-GFP载体中，表明[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP载体构建成功。

[FK（W10][TPWYY6.tif][FK）]

2.5花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因超表达载体构建

将带有[WTBX][STBX]AhNCED1的克隆载体pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1、植物表达载体pCambia2300EC同时利用限制性内切酶SacⅠ进行单酶切，植物表达载体pCambia2300EC酶切结果见图8，pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1酶切结果见图7-A。回收目的片段和载体片段，利用连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆测序。测序结果表明，[WTBX][STBX]AhNCED1片段已准确插入到植物表达载体pCambia2300EC上。

[FK（W25][TPWYY7.tif][FK）]

[FK（W12][TPWYY8.tif][FK）]

3讨论与结论

种子缺乏休眠性既可能与种子内源ABA含量低有关，也可能是种子本身对ABA的敏感性降低所致[12]。ABA生物合成基因的过量表达可以增加种子中ABA的含量，从而促进种子休眠或延迟萌发[13]。NCED是ABA合成途径中关键酶。拟南芥中有5个NCED基因，只有[WTBX][STBX]AtNCED6、AtNCED9这2个基因都发生突变的拟南芥种子才能萌发，若只有1个基因突变，种子仍然处于休眠状态[14]。乙烯利作用下花生种子休眠解除过程中，ABA合成关键基因[WTBX][STBX]AhNCED2表达量下调[10]，这表明[WTBX][STBX]AhNCED2在种子休眠中起着重要作用。研究蛋白在细胞中的定位方法主要有融合报告基因定位法、免疫组织化学定位法、蛋白质组学定位技术以及共分离标记酶辅助定位法，其中融合报告基因定位法应用广泛[15]。本研究在花生中克隆到1个NCED基因，经过生物信息学分析，认为是花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因。笔者对其序列进行了分析，并成功构建了该基因的亚细胞定位载体和超表达载体，为深入了解该基因在花生中的功能提供了可能。

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