青蒿不同部位总RNA提取方法比较

周敏 付金娥 韦树根 潘丽梅

摘要：为从青蒿中提取高质量的RNA，以青蒿叶片、茎、根和花为材料，采用TRIzol法、改良TRIzol法、十六烷基三甲基溴化铵-LiCl（CTAB-LiCl）法、CTAB-异丙醇法4种方法，比较不同材料不同方法分离RNA的效果。结果表明，4种方法所提RNA纯度均较高，其中改良TriZol法所提RNA质量最好。

关键词：青蒿；RNA提取；改良TRIzol法；蛋白质

中图分类号： Q522文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0031-02

收稿日期：2015-09-29

基金项目：國家自然科学基金（编号：81560623）；广西自然科学基金（编号：2013GXNSFAA019221、2013GXNSFBA019180）。

作者简介：周敏（1991—），女，江西赣州人，硕士研究生，主要从事药用植物资源育种方面研究。E-mail：zmlww1020@163.com。

通信作者：韦树根，硕士，副研究员，主要从事药用植物资源、繁殖、育种等方面的研究。E-mail：weishugen2@163.com。

2015版《中华人民共和国药典》规定，青蒿为菊科植物黄花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分[1]。青蒿苦、辛、寒，具有清虚热、除骨蒸、解暑热、截疟、退黄的功效，多用于治疗温邪伤阴、夜热早凉、阴虚发热、骨蒸劳热、暑邪发热、疟疾寒热、湿热黄疸等疾病。随着青蒿素被发现是治疗疟疾的首选药物，挽救了全球特别是发展中国家数百万人的生命，使得青蒿一直以来是研究的热点。目前青蒿的研究不仅从资源、栽培、育种等传统技术方面进行，还从分子生物学的角度阐明青蒿生长和发育机制及其有效成分青蒿素合成和累积机制等方面进行。因此，提取高质量、高纯度、完整性好的RNA是分子生物学研究的重要基础，对于进行逆转录PCR（RT-PCR），cDNA合成、RNA序列分析、Northern印迹杂交等具有重要意义。由于植物组织中化学成分复杂，并没有一种RNA提取方法适用于所有的植物[2]。青蒿的化学成分主要有挥发油类、香豆素类、萜类、黄酮类、苯丙酸类及其他类成分[3]，复杂的化学成分增加了青蒿RNA提取的难度，且前人也未系统地对青蒿不同部位RNA提取进行研究。本研究通过比较TRIzol法、改良TRIzol法、十六烷基三甲基溴化铵-LiCl（CTAB-LiCl）法和CTAB-异丙醇4种方法提取青蒿不同部位的RNA，不仅进一步地为青蒿进行RT-PCR、cDNA合成、RNA序列分析、Northern印迹杂交等分子生物学试验提供基础，还为近缘种植物RNA的提取提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

2015年8月，采集广西药用植物园栽培基地的青蒿叶片、茎、花、根等作为试验材料，立即用液氮速冻后置于 -80 ℃ 冰箱保存备用。

1.2试验试剂

TRIzol试剂盒、三氯甲烷、异丙醇、三氯甲烷+异戊醇（24 ∶[KG-*3]1）、苯酚、75%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）水、CTAB、8 mol/L LiCl、1%琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液。

1.3试验仪器

主要仪器：Eppendorf移液枪，Sigma Sartorius台式冷冻离心机，涡旋振荡仪器，Bio-Rad电泳仪，ChemiDoc XRS凝胶成像系统，MILIPORE超纯水机，制冰机（北京长流科学仪器公司），恒温干燥箱（上海天恒医疗器械有限公司），微量分光光度计，水浴锅。

1.4操作方法

1.4.1TRIzol试剂盒法

取0.2 g植物组织，在液氮中研磨成细粉，转移至装有1 mL TRIzol的1.5 mL离心管中，再加入0.2 mL三氯甲烷颠倒混匀15 s，室温静置3 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min；取上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，涡旋混匀，室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，沿试管壁加入1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min离心5 min，弃上清液，室温干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.2改良TRIzol法

取0.2 g植物组织，在液氮中研磨成细粉，转移至装有1 mL TRIzol的1.5 mL离心管中，涡旋振荡1 min，4 ℃、2 000 r/min离心15 min；取上清液转移至新的离心管中，加入等体积苯酚+三氯甲烷+异戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1）溶液，涡旋振荡1 min，室温静置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的三氯甲烷+异戊醇，室温静置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min离心 15 min，加入等体积三氯甲烷，室温静置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min；取上清液200 μL转移至新的离心管中，加入 0.5 mL 预冷的异丙醇，颠倒混匀8～10次，室温静置8～10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，试管壁加入1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min离心5 min，弃上清液，室温干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.3CTAB-LiCl法

取0.2 g液氮研磨的样品迅速转移至60 ℃预热的含有600 μL CTAB的离心管中，涡旋振荡 30 s，于60 ℃水浴2 min，其间颠倒混匀2～3次，室温冷却 1 min 后加入等体积三氯甲烷+异戊醇溶液，涡旋振荡1 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取上清液，加入等体积的三氯甲烷+异戊醇溶液，涡旋振荡1 min，4 ℃、12 000 r/min离心 15 min；将上清液转移至新的离心管中，加入1/3体积的 8 mol/L LiCl，4 ℃过夜沉淀，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清液，加1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min离心 5 min，弃上清液，室温干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.4CTAB-异丙醇法

步骤同CTAB-LiCl法，用等体积的异丙醇沉淀。

1.5RNA的质量检测

用1%琼脂糖凝胶检测RNA的纯度和完整性，用微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度。D260 nm/D280 nm为1.8～20、D260 nm/D230 nm为2.0～2.3，表明RNA样品纯度高。

2结果与分析

2.1TRIzol法提取RNA效果

由图1、表1可见，电泳结果显示有3条条带，且条带清晰；叶片和根的D260 nm/D280 nm值<1.80，图1中18S条带有拖尾，说明RNA已有部分降解。结果表明，用此方法提取的RNA浓度较低。

2.2改良TRIzol法提取RNA效果

由图2、表2可见，改良TRIzol法电泳可见3条清晰条带，无拖尾，带与带之间无明显弥散现象；D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.1间，说明RNA在整个提取过程中结构完整，未发生明显降解；D260 nm/D230 nm值均在2.0～2.3间，说明去DNA和蛋白质效果很好。改良后样品浓度较高，可用于进一步的分子试验。

2.3CTAB-LiCl法提取RNA效果

由图3、表3可见，电泳结果有18S、28S条带，5S条带模糊，不清晰，不适合用于小RNA的分析，此方法沉淀RNA时，沉淀有颜色，可能是有些物质未去除干净；其中叶片提取的RNA D260 nm/D280 nm值<1.8，RNA有所降解，说明此方法不适合叶的提取。

2.4CTAB-异丙醇法提取RNA效果

由图4、表4可见，电泳结果与CTAB-LiCl法相同，5S条带模糊，不清晰；但用此方法提取的RNA浓度比CTAB-LiCl高，其中花的D260 nm/D230 nm值<2.0，可能有蛋白质残留或者次生代谢物没有抽提完全。

3讨论

[JP2]组织的破碎程度、RNase的活性、多糖和蛋白质等大分子物质的存在[4]都会影响RNA提取的质量。TRIzol试剂盒法比较简单方便，耗时也较短，但是可能由于步骤比较简单，对杂质的去除不够彻底[5-6]。改良后的TRIzol，加了苯酚，能更好去除蛋白质、多酚、多糖等物质，通过电泳图、D260 nm/D280 nm值可知，浓度和纯度也较高，符合转录组、基因克隆等高通量试验的要求。5S条带缺失或不清晰是CTAB法提取RNA的不足之处，此方法提取的RNA不能用于小RNA的分析。

LiCl本身沉淀大片段RNA效果好的特点使得到的RNA大片段损失很少，更适于进行后续的分子生物学试验；而异丙醇沉淀获得的沉淀体积大，导致多糖和酚类物质的共沉淀作用，因而CTAB-LiCl比CTAB-异丙醇更适合青蒿RNA的提取。因此，青蒿不同部位RNA用TRIzol法提取的比用CTAB法质量更好，条带清晰、完整，且TRIzol法比CTAB法用时更短，效率更高。[JP]

[HS2*3]参考文献：

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[M]. 北京：化学工业出版社，2010.

[2]Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinones in the isolation of plant enzymes and organelles[J]. Meth Enzymol，1974，31（A）：528-545.

[3]張秋红，朱子徽，李晋，等. 中药青蒿化学成分与种植研究现状[J]. 中国医药导报，2011，8（19）：10-12.

[4]Sambrool，J，Fritscli E F，et al. Molecular cloning：a laboratory manuals[M]. 2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：343-361.

[5]赖茜，余迪求. 4种榕树总RNA提取方法的比较[J]. 云南大学学报（自然科学版），2008，30（6）：636-640.

[6]印华，周兆德，吴志祥. 2种荔枝RNA提取方法的比较[J]. 热带农业工程，2009，33（2）：1-4.