莱克多巴胺钐标记时间分辨荧光免疫分析方法的建立

摘要：基于抗莱克多巴胺（SAL）的单克隆抗体，初步建立了检测SAL的高灵敏度时间分辨直接竞争免疫分析法（CD-TRFIA）。采用辛酸-硫酸铵纯化抗SAL杂交瘤细胞株腹水单克隆抗体，用稀土离子Sm3+偶联物进行标记，制备钐标抗体；通过合成SAL-SUC半抗原并与卵清蛋白偶联获得SAL-OVA包被抗原；采用直接竞争的方式，游离SAL和固相SAL-OVA包被原共同竞争有限的钐标SAL单抗，初步建立SAL时间分辨免疫分析方法。研究发现，优化的TRFIA半抑制量IC50为1.6 ng/mL，检测范围为0.39～12.77 ng/mL，最低检测限为0.136 ng/mL。

关键词：莱克多巴胺；钐标单克隆抗体；时间分辨荧光免疫分析

中图分类号： TS207文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0036-05

收稿日期：2016-05-14

基金项目：内蒙古自治区高等学校科学研究项目（编号：NJZC13407）；内蒙古商贸职业学院课题项目（编号：NSZY1113）。

作者简介：李贞（1980—），男，硕士，讲师，主要从事食品加工与营养检测的教学与研究。E-mail：563983393@163.com。

时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）是20世纪80年代初由Pettersson等创立的一种非放射性标记免疫分析技术，与传统的荧光素标记不同，它以钐（Sm）、铽（Tb）、钐（Sm）、铌（Nd）等三价稀土离子镧系元素为标记物，代替荧光物质、同位素、酶、化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等。这些离子可产生荧光，其荧光不仅强度高，且荧光衰变时间长，利用延缓测量时间，当待测样品中短寿命的自然荧光衰变后再用TRFIA技术检测，可消除自然荧光的干扰。

TRFIA技术在食品安全领域的应用研究已逐渐开展[1-5]，在黄曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、醋酸甲羟孕酮、氯霉素等分析中相继建立起来。关于β-肾上腺素受体兴奋剂的TRFIA研究已有报道，其中莱克多巴胺检测的TRFIA方法研究表明，其检测限低（0.1 μg/kg），在多种基质中的准确度高、变异系数低，与传统的ELISA方法比较其相关性好、灵敏度高，表明TRFIA方法用于检测β-兴奋剂类药物具有广阔前景[2-3]。莱克多巴胺（ractopamine，SAL）是“瘦肉精”克伦特罗的替代品，作为动物生长促长剂在畜牧生长中滥用的现象非常严重，是食品安全检测的重点监控对象。目前，莱克多巴胺检测以仪器分析方法为主，研究开发出成本低廉、操作简便、检测迅速、灵敏度高的免疫分析检测技术显得尤为重要。ELISA作为一种传统的免疫分析形式，在莱克多巴胺检测中已有应用报道，但检测灵敏度有待提高。时间分辨免疫分析作为一种超灵敏的痕量分析手段，在莱克多巴胺检测中未见报道。本研究以莱克多巴胺单克隆抗体的制备为基础，建立TRFIA免疫学检测方法，以开发能够检测莱克多巴胺的时间分辨荧光免疫试剂盒。

1材料与方法

1.1仪器设备

U-3010型紫外可见分光光度计（日本Hitachi公司），Wallac VITOR31420型多標记分析仪（美国Thermo公司），Wellwash MK2型洗板机（美国Thermo公司），6K15型冷冻离心机（Sartorius-Sigma公司），82-5型控温磁力搅拌器（金坛市恒丰仪器厂），DK-8D型电热恒温水槽（上海医用恒温设备厂），BCD-191W/H型可调数显冰箱（Kelon公司），特制层析柱（1.5 cm×20 cm）（上海华美仪器设备有限公司），自动收集器（Bio-Rad公司），超低温高速离心机（Sigma公司），恒温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司），微量可调移液枪（吉尔森公司），BP61S型电子天平（瑞士Sartorius公司），96孔微量反应板（雷博公司）。

1.2试剂

莱克多巴胺（含量大于99%）、克伦特罗（含量大于98%）购自美国Dr. Ehrenstorfer公司，羊抗小鼠IgG抗体、牛血清蛋白（98.6%）购自Sigma公司，磷酸二氢钠（分析纯）、乙二胺四乙酸二钠（分析纯）购自天津市化学试剂六厂，磷酸氢二钠（分析纯）购自汕头市光华化学厂，邻苯二甲酸氢钾购自天津市大茂化学试剂厂，新鲜阴性猪尿样由广州市兽药监督所提供。

1.3试剂配制

包被缓冲液/标记物缓冲液（pH值9.6、0.1 mol/L碳酸盐缓冲液）[4]：Na2CO3 0.375 g、NaHCO3 0.732 5 g，加蒸馏水定容至250 mL。洗涤缓冲液（pH值7.4 PBST）：KH2PO4 0.4 g、Na2HPO4·12H2O 5.8 g、NaCl 16 g、KCl 0.4 g、0.05% Tween-20 1 mL，加蒸馏水定容至2 000 mL。标记物洗脱液（pH值7.6、1 mol/L Tris-HCl）：Tris-Base 12.12 g、NaCl 9 g，加去离子水定容至1 L，采用6 mol/L HCl将pH值调至7.6。标记物稀释液：Tris-Base 6.056 g、NaCl 9 g，加去离子水定容至1 L，采用6 mol/L HCl将pH值调至7.6，再加入BSA 2 g、Tween-20 0.3 mL，滤膜过滤除菌。[LM]

1.4试验动物及细胞株

清洁级Balb/c纯种雌性小鼠购自中山医科大学实验动物中心。抗莱克多巴胺单克隆杂交瘤细胞株4E4由笔者所在实验室保存。

1.5SAL包被抗原的合成

参照黄飚等的方法[6]进行SAL包被抗原的合成。

1.6钐标抗体的制备与纯化

参照Shen等的方法[7]进行杂交瘤细胞株复苏及腹水制备，参照Shen等、王永成等的方法[7-8]进行辛酸-硫酸铵沉淀法分离纯化抗体，参照王永成等的方法进行Sm3+抗SAL单克隆抗体的制备[8]。

1.7Sm3+标记抗体稀释倍数与包被浓度估测

1.7.1固相抗原的制备

将SAL-OVA用包被缓冲液稀释为10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL 4个包被浓度，96孔微孔板中每个包被浓度各包3列，每孔加100 μL，于4 ℃下放置过夜。弃去包被液，用洗涤缓冲液洗板2次，拍干。加120 μL封闭液封闭，于37 ℃下封闭3 h，弃去封闭液，置于37 ℃烘箱中烘干，于4 ℃下密封保存。

1.7.2直接SAL-TRFIA棋盘滴定

将Sm3+标记抗体倍比稀释为250、500、1 000、2 000、4 000、8 000倍液共6个浓度，固相抗原包被浓度分别为8、4、2、1 μg/mL。96孔酶标板中，每行为1个抗体稀释浓度，每列为1个包被浓度。加入 50 μL 抗体至预加50 μL抗体稀释液的酶标孔中，于37 ℃下振荡反应1 h，洗板6次，拍干；加增强液200 μL，振荡反应 10 min，采用Wallac VICTOR3 1420型多标记分析仪测量其CPS值。

1.8时间分辨免疫分析方法的建立

1.8.1SAL标准液的配制

采用PBST稀释液将纯度为99%的SAL硫酸盐配制成浓度为100 μg/mL的母液，稀释至 1 μg/mL 作为贮备液，使用前配制成浓度梯度为0.000、0.256、0.640、1.600、4.000、20.000、100.000 ng/mL的SAL标准品工作液。

1.8.2直接竞争SAL-TRFIA步骤

添加标品与钐标抗体各50 μL，每孔做1个重复，于37 ℃下振荡反应1 h，洗板6次，拍干，添加增强液200 μL，振荡反应10 min，采用Wallac VICTOR3 1420型多标记分析仪测量其CPS值。

1.8.3最佳Sm3+标记抗体稀释度的确定

按“1.8.2”节估测的包被浓度进行包板，将钐标抗体进行系列稀释，稀释倍数分别为350、400、450、500倍，测定各稀释度荧光计数。以标准点（SAL浓度）为横坐标，以各稀释度荧光计数（CPS）与最高浓度荧光计数（CPSmax）的比值为纵坐标，测定荧光值并绘制曲线，确定最佳Sm3+标记抗体稀释度。

1.8.4最佳包被浓度的确定

取3条96孔微孔板反应条，用包被液对SAL-OVA进行一系列稀释，浓度为1.50、1.25、1.00 μg/mL，进行包被，按照棋盘滴定初步筛选出的浓度稀释抗体，按照“1.7.2”节的步骤测定各稀释度荧光计数。绘制标准曲线，曲线灵敏度较高、曲线斜率较大的抗原浓度即为最适包被工作浓度。

1.8.5最佳竞争时间的确定

将工作浓度稀释的钐标抗体和SAL标准液加入确定包被浓度的SAL-OVA包被板中，于37 ℃下分别温育30、60、90、120 min，其他步骤同“1.8.3”节，测定不同竞争时间下的标准曲线。

1.8.6最佳反应体系的确定

在包被好的板条中分別加入标准品50 μL和钐标抗体50 μL（体系1）、标准品100 μL和钐标抗体50 μL（体系2）、标准品50 μL和钐标抗体100 μL（体系3）、标准品100 μL和钐标抗体100 μL（体系4），根据各反应体系的最终反应体积分别加入增强液100、150、200 μL，振荡10 min，绘制标准曲线，确定最佳反应体系。

1.9SAL-TRFIA方法的标准曲线建立

采用最佳模式的最佳条件操作，用Wallac VIVTOR3 1420型多标记分析仪测定荧光值得到标准曲线，从而确定其IC50与检测的线性范围。

1.10SAL-TRFIA方法的灵敏度、精密度和特异性

做SAL为零浓度的孔8个，以零剂量点计数率（CPS）均值减3倍标准差后的计数率在标准曲线上得到的相应浓度值为检测的灵敏度。以标准曲线制备的板内误差和板间误差来表示方法的精密度。以系列浓度的SAL及莱克多巴胺、克伦特罗2种近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在IC50时的浓度交叉反应率。

2结果与分析

2.1SAL-OVA包被抗原的制备

通过混合酸酐法合成SAL-SUC-OVA包被原，由紫外扫描后的结果（图1）可知，SAL-SUC-OVA在280 nm处的吸收值明显高于OVA和SAL-SUC，从而可确定SAL-SUC已与OVA偶联成功。

[TPLZ1.tif][FK）]

2.2钐标抗体的制备与纯化

经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后，腹水抗体浓度为 3.96 mg/mL。经ic-ELISA检测，纯化腹水抗体对SAL具有较强的识别能力，且效价较高。将经过钐标后的抗体利用Sephardex G25（1 cm×40 cm）层析柱纯化，进行紫外检测（图2）和荧光检测（图3）。检测结果表明，Sm3+标抗体与游离钐的分离度较高，紫外检测和荧光值检测的出峰管数与游离钐出峰管数基本相同，第1个峰值是钐标成功的抗体，第2个峰值是游离钐。由图3可知，21～25管是没有被游离钐污染的纯化钐标抗体，且其荧光计数值均大于40万。

2.3Sm3+标记抗体反应稀释倍数与包被浓度

CPSmax值呈现随包被浓度逐渐增大的趋势，其中 8 μg/mL 时荧光读数达到最高值，4、2、1 μg/mL的荧光读数均较为接近；随着稀释倍数的增大，其荧光值下降较快（表1）。[CM（23*2/3]为降低试验成本和提升检测效果，应选取CPSmax值在10 000～12 000时，包被浓度和抗体浓度均达最低值的组合，即包被浓度为1 μg/mL，抗体稀释倍数为500倍。

2.4时间分辨免疫分析方法的建立

2.4.1钐标抗体稀释倍数的确定

由于钐标抗体制备成本高，先对钐标抗体稀释倍数进行优化（图4、图5）。当包被抗原浓度为1.25 μg/mL时，反应的CPSmax值随着Sm3+标抗体稀释倍数的增加而显著下降，与抗体稀释倍数相对应，其IC50值分别为3.26、3.84、5.83、5.83 ng/mL。当抗体稀释倍数为350倍与400倍时，其IC50值相近，灵敏度与其他2个稀释倍数相比较高。综合考虑抗体成本和曲线灵敏度，选择CPS值高的400倍作为最佳抗体稀释倍数。

2.4.2包被浓度检测

由棋盘滴定得到的结果可初步得知，包被浓度为1 μg/mL时反应较为理想，进一步设置3个包被浓度（1.00、1.25、1.50 μg/mL）的SAL-OVA进行固相包被，将钐标抗体进行400倍稀释参与反应。结果表明，3种包被浓度对应的药物抑制曲线拟合度较好（图6），差异不大。比较不同包被浓度拟合曲线的CPSmax和IC50发现，CPSmax随着包被浓度的增加呈上升趋势，不同包被浓度拟合的曲线IC50有所区别，3个包被浓度对应的IC50分别为3.67、2.43、3.66 ng/mL（图7）。综合考虑灵敏度与荧光值， 当包被浓度为1.25 μg/mL时，TRFIA荧光值适中，且其灵敏度较高，因此选取1.25 μg/mL为最佳包被浓度。

2.4.3竞争时间的确定

采用抗原包被浓度1.25 μg/mL、钐标抗体稀释倍数400倍，探讨不同竞争时间（30、60、90、120 min）对灵敏度的影响（图8、图9）。标准曲线的CPSmax值隨着竞争时间的延长呈上升趋势，但其灵敏度并不随之提高，反应30～120 min的IC50值分别为1.90、1.88、2.83、2.66 ng/mL，由此可知竞争时间过长会导致非特异吸附产生，从而降低分析灵敏度。温育30 min时其CPSmax值较低，表明在短时间段内抗原抗体反应并不完全；温育60 min时所对应的CPSmax值适中，且IC50较低，表明竞争反应已经进行充分，基本平衡，因此最佳的竞争时间为60 min。

2.4.4竞争模式的确定

考察4种反应模式对灵敏度的影响。体系1：50 μL SAL+50 μL Sm3+-McAb，共100 μL。体系2：100 μL SAL+50 μL Sm3+-McAb，共150 μL。体系3：50 μL SAL+100 μL Sm3+-McAb，共150 μL。体系4：100 μL SAL+100 μL Sm3+-McAb，共200 μL。

由图10、图11可知，体系2、体系3中SAL与钐标抗体的比例分别为2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2，IC50值分别为2.11、3.11 ng/mL。体

系2中，由于钐标抗体添加比例低，从低浓度开始药物便对抗体有较明显的抑制作用，导致荧光值过低，抑制曲线拟合程度低。体系3中，钐标抗体添加比例高，CPSmax适中，但药物比例低，药物对抗体抑制不充分，因此灵敏度较低。而体系1、体系4的SAL与钐标抗体是等量的，竞争反应完全，体系总体积相异，灵敏度有明显差异，反应体系增大导致灵敏度下降。选取钐标抗体与药物等量且钐标抗体添加量少、反应灵敏度高的体系1为最佳反应体系。

2.5SAL-TRFIA方法的标准曲线建立

按照优化方案的结果，包被抗原直接竞争TRFIA法的最优化条件为：钐标稀释400倍、包被浓度1.25 μg/mL、反应时间1.0 h、反应体系为体系1。按照最优条件，标准品的浓度为0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 ng/mL时，建立SAL时间分辨免疫分析方法的标准曲线（图12）。曲线线性好，其中半抑制量（IC50）为1.6 ng/mL，最低检测限（IC10）为 0.136 ng/mL，检测范围（IC20～IC80）在0.39～12.77 ng/mL。

2.6SAL-TRFIA方法的精密度和特异性

取6个不同浓度的SAL标准溶液进行时间分辨分析，每个浓度设8个重复孔，进行精密度测试（表2）。由表2可知，板内、板间的平均差异均在15%以内，表明建立的TRFIA方法精密度良好、稳定性高。

利用药物莱克多巴胺、克伦特罗，采用所建立的莱克多巴胺钐标记时间分辨荧光免疫法进行交叉反应。结果显示，与克伦特罗的交叉较小，仅有 2.29%，而与莱克多巴胺基本没有交叉，表明基于抗SAL-单克隆抗体的TRFIA特异性良好。[JP]

2.7SAL-TRFIA方法的准确性

各取猪肉、猪肝、猪尿、饲料样品3份，分别加入高、中、低浓度的药物进行准确性试验（表3）。由表3可知，TRFIA方法测定SAL在猪肉、猪肝、猪尿、饲料4种基质中的平均加标回收率分别为98.02%、96.03%、108.73%、106.09%，基本在80%～120%之间。

3结论与讨论

莱克多巴胺（SALbutamol，SAL）是“瘦肉精”克伦特罗的替代品，作为动物生长促长剂在畜牧生产中滥用的现象非常严重，是食品安全检测的重点监控对象。[JP+1]目前，莱克多巴胺检测以仪器分析方法为主，研究开发成本低廉、操作简便、检测迅速、灵敏度高的免疫分析检测技术显得尤为重要。ELISA作为一种传统的免疫分析形式，在莱克多巴胺检测中的应用已有报道，但检测灵敏度有待提高。时间分辨免疫分析作为一种超灵敏的痕量分析手段，在莱克多巴胺检测中未见报道。[JP]

本研究基于抗SAL的单克隆抗体，初步建立了检测SAL的高灵敏度时间分辨直接竞争免疫分析法（CD-TRFIA）。采用辛酸-硫酸铵纯化抗SAL杂交瘤细胞株腹水单克隆抗体，用稀土离子Sm3+偶联物进行标记，制备钐标抗体；通过合成SAL-SUC半抗原并与卵清蛋白偶联获得SAL-OVA包被抗原；采用直接竞争的方式，游离SAL和固相SAL-OVA包被抗原共同竞争有限的钐标SAL单抗，初步建立SAL时间分辨免疫分析方法。研究发现，优化的TRFIA半抑制量IC50为1.6 ng/mL，检测范围为0.39～12.77 ng/mL，最低检测限为0.136 ng/mL。对其他常用β-兴奋剂进行交叉反应分析发现，建立的TRFIA方法特异选择性高，与克伦特罗的交叉率较小（2.29%），而与莱克多巴胺没有交叉。将建立的 TRFIA 方法与基于同源单克隆抗体而建立的酶联免疫分析法（ELISA）、荧光偏振免疫分析（FPIA）进行比较分析，结果表明，TRFIA方法的灵敏度、检测性能与ELISA和FPIA方法相比有不同程度的提高。

参考文献：

[1]谢敏浩，罗世能. 时间分辨荧光免疫分析螯合剂BCPDA合成[J]. 化学试剂，1994，16（6）：359-360.

[2]Faeste C K，Holden L. Sensitive time-resolved fluoroimmunoassay for the detection of hazelnut protein tSALes in food matrices[J]. Journal of Immunological Methods，2006，314：114-122.

[3]潘利华，周誓红，孙文伟，等. 固相时间分辨荧光免疫标记技术研究[J]. 光谱学与光谱分析，2004，24（12）：1601-1604.

[4]王蕾，吴英松，汤永平，等. 应用时间分辨荧光免疫分析技术检测SARS病毒抗原的初步研究[J]. 第一军医大学学报，2005，25（4）：429-431，434.

[5]黄飚，陶文沂，张莲芬，等. 赭曲霉毒素A的高灵敏时间分辨荧光免疫分析[J]. 生物化学与生物物理进展，2005，32（7）：662-666.

[6]黄飚，陶文沂，张莲芬，等. 黄曲霉毒素B1的高灵敏时间分辨荧光免疫分析[J]. 核技术，2006，29（4）：295-300.

[7]Shen J Z，Zhen Z Y Y. Time-resolved fluoroimmunoassay for SAL to pamine in swin tissue[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，387：1561-1564.

[8]王永成，唐棣，常文保，等. 时间分辨荧光免疫分析法间接测定雌二醇[J]. 分析科学学报，2001，17（2）：89-92.[HJ][FL）]