2种模式细菌对人参皂苷的化学趋向性响应

李 琼， 张爱华， 郑 颖， 匙 坤， 杨 鹤， 卢宝慧， 许永华， 张连学

(1.吉林农业大学中药材学院/吉林省人参工程技术研究中心，吉林长春 130118；2.潍坊工程职业学院应用化学与生物工程学院，山东潍坊 262500)

2种模式细菌对人参皂苷的化学趋向性响应

李 琼1， 张爱华1， 郑 颖2， 匙 坤1， 杨 鹤1， 卢宝慧1， 许永华1， 张连学1

(1.吉林农业大学中药材学院/吉林省人参工程技术研究中心，吉林长春 130118；2.潍坊工程职业学院应用化学与生物工程学院，山东潍坊 262500)

采用毛细管法测定大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)在4种趋化参数(浓度、温度、pH值和时间)下对人参总皂苷的化学趋向性响应。结果表明，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌对低浓度人参总皂苷表现出较强的化学趋向性，与阴性对照组相比，趋化指数分别为3.868、3.755；与阳性对照组相比，趋化指数分别为1.075、1.175。研究结果显示，低浓度的人参总皂苷对2种细菌的化学趋向性有促进作用，但是随着浓度的增加而减弱。

人参总皂苷；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；化学趋向性

人参(PanaxginsengC. A. Mey.)为五加科人参属重要药用植物，是我国的名贵中药材。然而在人参生长过程中，连作障碍是影响其规范化种植的主要因素之一。据报道，植物连作障碍的发生是由多方面因素导致的，如病虫害高发、自毒物质积累、土壤营养失衡、土壤恶化等[1]。在近几年的研究中，根系分泌物生态效应的间接作用及土壤微生物种群比例失调被视为诱发植物连作障碍的主要因素，某些种群微生物可借助趋化感应(chemotaxis response)利用根系分泌物中的特定组分，实现快速增殖，从而对其他有益微生物的生长产生抑制，以此改变分泌物中的组分和数量，进而为趋化性病原微生物提供更多碳源、能源，形成恶性循环，使植物生长发育不良[2-6]。

人参皂苷是人参根系分泌物中一类主要次生代谢产物，它不仅被视为土壤微生物的基质，同时也在植物体与土壤微生物之间起着调节作用[7-9]。人参病害暴发流行时期正是人参根系分泌物分泌最旺盛时期，病害高发是导致人参连作障碍的先决条件。然而在这期间，关于人参皂苷是否对人参根际微生物起到趋化作用、能否保持土壤微生态平衡等未见相关报道。大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分别属于革兰氏阴性细菌(G-)、革兰氏阳性细菌(G+)，通常被作为模式微生物来研究，这2种细菌在自然界中无处不在，在空气、土壤、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到它们。大多数学者关注这2种细菌在人体或动物体内的卫生学及致病性，而忽视了它们在自然界中的存在对植物生态方面的影响。本试验以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为模式菌株，探讨人参皂苷对其化学趋向性的影响，以期为人参根际微生物的化学趋向性响应的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.1.2 供试药品 人参根系总皂苷由吉林农业大学张春红博士提供(纯度80%)。氯化钠(分析纯)，北京化学工业集团有限责任公司；牛肉膏(生物试剂纯度)、蛋白胨(生物试剂纯度)，北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉(H8145)，上海稼丰园艺用品有限公司。

1.1.3 培养基 采用牛肉膏-蛋白胨培养基，液体培养基配方：5.0 g/L牛肉膏，10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L NaCl，pH值7.2～7.4；固体培养基配方：5.0 g/L牛肉膏，10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L NaCl，20 g/L琼脂，pH值7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备 将-70 ℃保存的菌种接种到牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，于37 ℃条件下培养18～24 h。挑取单菌落于适量稀释液(0.90% NaCl，pH值7.2)中，充分振荡混匀后制成一定浓度的菌液(约108CFU/mL，D625 nm=0.1)，通过稀释得到107CFU/mL的菌液，备用。

1.2.2 皂苷溶液的制备 用蒸馏水配制浓度分别为 12.500 0、1.250 0、0.125 0、0.012 5 mg/L的人参总皂苷溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。

对照设置：CK1为阴性对照，成分是无菌水；CK2为阳性对照，成分为无菌肉汤培养液。

1.2.3 化学趋向性反应试验 采用改进的毛细管法进行化学趋向性反应试验[10]，玻璃毛细管(内径为0.5 mm)一端吸入人参总皂苷趋化待测液，另一端用热熔胶封闭。将毛细管插入到含500 μL菌液的1 mL注射器中，37 ℃下水平孵育 60 min。用无菌水冲毛细管外壁以去除附着的菌液，折断毛细管后将内含物转入EP管中，加入40 μL无菌水稀释3倍，再将溶液吸出，均匀涂抹在固体平板上，反复操作5次。平板于37 ℃培养24 h，统计单菌落的平均数。以单菌落的数量来衡量大肠杆菌和金黄色葡萄球菌化学趋向性的大小。

1.2.4 趋化指数的测定 趋化指数=(S-SCK)/SCK。式中：S为2种细菌对人参总皂苷的趋化参数；SCK为2种细菌相较于对照试验组的趋化参数。

1.2.5 不同浓度人参总皂苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌化学趋向性的影响 将配置好的人参总皂苷溶液(12.500 0、1.250 0、0.125 0、0.0125 mg/L)按“1.2.3”节的方法进行趋化试验。

1.2.6 温度对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌化学趋向性的影响 将2种细菌置于不同温度(25、30、35、40 ℃)下培养，按“1.2.3”节的方法进行趋化试验，其中培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的人参总皂苷浓度分别为0.012 5、0.125 0 mg/L。

1.2.7 pH值对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌化学趋向性的影响 分别将浓度为0.012 5、0.125 0 mg/L的人参总皂苷溶液配制成不同的pH值(5、6、7、8)，按“1.2.3”节的方法进行趋化试验，2种细菌都在40 ℃条件下培养。

1.2.8 培养时间对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌化学趋向性的影响 将pH值为7、浓度分别为0.012 5、0.125 0 mg/L的人参总皂苷溶液设置不同培养时间(0、30、45、60、75 min)，按“1.2.3”节的方法进行趋化试验，2种细菌都在40 ℃条件下培养。

1.2.9 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在最优趋化参数下对人参总皂苷的化学趋向性响应 综合筛选以上4种条件下趋化现象最为明显的试验参数，按“1.2.3”节的方法进行趋化试验。

1.2.10 数据分析 本试验均重复5次，试验数据取“平均值±标准差”。试验数据采用Excel 2007软件进行处理，利用SPSS 18.0中的单因素方差分析(One-Way ANOVA)结合LSD法对统计结果进行显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度人参总皂苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌化学趋向性的影响

如图1所示，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别对4种浓度的人参总皂苷表现出化学趋向性响应。其中，当人参总皂苷浓度为0.012 5 mg/L时，大肠杆菌的化学趋向性最明显，而金黄色葡萄球菌则对0.125 0 mg/L浓度的人参总皂苷的化学趋向性最强，且二者都显著高于对照1、对照2(P<0.05)，趋化指数分别为3.891、1.155，3.929、1.206。随着溶液浓度的逐级递增，大肠杆菌的化学趋向性减弱，而金黄色葡萄球菌的化学趋向性先增强后减弱，呈现低浓度大于高浓度的趋势。

2.2 温度对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌化学趋向性的影响

如图2所示，当培养温度不同时，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌对人参总皂苷都表现出敏感的化学趋向性，且2种细菌的化学趋向性都随温度的增加而增强。一个有趣的现象是，2种细菌在培养温度为25、30 ℃试验组中所表现出来的化学趋向性要显著低于35、40 ℃试验组(P<0.05)，而在培养温度为40 ℃的试验组中，2种细菌所表现出的化学趋向性最强、单菌落数量最多，且均显著高于其他试验组(P<0.05)。

2.3 pH值对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌化学趋向性的影响

如图3所示，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌对不同pH值的人参总皂苷培养液均表现出化学趋向性响应，但是随着pH值的逐渐增加，2种细菌的化学趋向性都出现先增强后减弱的趋势。中性和偏碱性(pH值=7、8)试验组的化学趋向性要明显强于酸性、偏弱酸性(pH值=5、6)试验组(P<0.05)，且都在pH值=7时达到最大趋化值。结果显示，当pH值继续增加，不会增强2种细菌的化学趋向性响应，这可能与细菌生存的最适pH值存在一定的偶联关系。

2.4 培养时间对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌化学趋向性的影响

如图4所示，随着培养时间的延长，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌对人参总皂苷的化学趋向性都呈现先增强后减弱的趋势，且都显著高于0 min试验组。其中，2种细菌在培养60、75 min时的化学趋向性明显高于培养30、45 min试验组，尤其在60 min时的化学趋向性最强且显著高于其他试验组(P<0.05)。结果还表明，随着培养时间的进一步延长， 2种

细菌的化学趋向性会受到一定的限制。

2.5 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在最优趋化参数下对人参总皂苷化学趋向性的响应

如图5所示，通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行不同人参总皂苷浓度、培养温度、pH值及趋化时间条件下的化学趋向性研究发现，大肠杆菌对于浓度为0.012 5 mg/L的人参总皂苷，在pH值=7、培养温度为40 ℃、培养时间为 60 min 的条件下达到最大趋化值，显著高于对照1、对照2(P<0.05)，趋化指数分别为3.868、1.075；而金黄色葡萄球菌则对浓度为0.125 0 mg/L的人参总皂苷在pH值=7、培养温度为40 ℃、培养时间为60 min时达到最大趋化值，显著高于对照1、对照2(P<0.05)，趋化指数分别为3.755、1.175。由此看出，2种模式细菌在最优趋化参数条件下对人参总皂苷都表现出较强的化学趋向性响应。

3 结论与讨论

有报道指出，不同浓度下的人参根系分泌物不仅影响人参根际微生物的生长、繁殖及种群分布，而且分泌物中自毒性物质的浓度效应同样影响人参种子的萌发及幼苗生长[11-17]。自然条件下次生代谢物质的浓度效应对于阐明化学趋向性具有重要意义，只有在特定的浓度下才能显示较强的化学趋向性响应。在本试验中，2种模式细菌都对低浓度的人参总皂苷表现出较强的化学趋向性响应，但是随着浓度的增加而减弱。于是笔者推测，低浓度的人参根系分泌物可能会引起人参根际土壤微生物的化学趋向性响应，以至于改变微生物的群落结构，进而对人参的生长产生一定影响。

在自然界中，存在许多与植物生长代谢相关的微生物，且它们其中大部分都具有群体效应，如某些植物病原菌可利用自身群体效应来调控对宿主植物根际的定殖过程及其致病性[18-19]。然而人参根际土壤中的微生物是否存在群体效应，其作用机制又是什么，这种效应与人参根系分泌物及某些趋化性微生物之间又存在何种联系等还有待深入研究。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.035

2015-11-18

国家科技支撑计划(编号：2011BAI03B01)；国家自然科学基金(编号：31100239、31200224、31470420)；吉林省科技发展计划(编号：20130206030YY、20140520159JH)。

李 琼(1990—)，男，辽宁锦州人，硕士研究生，主要从事药用植物栽培研究。E-mail：wode17k@163.com。

许永华，博士，副研究员，硕士生导师，主要从事药用植物栽培加工研究，E-mail：xuyonghua777@yeah.net；张连学，博士，教授，研究方向为药用植物栽培与加工，Tel：(0431)84532952，E-mail：zlxbooksea@163.com。

S567.5+10.1

A

1002-1302(2017)02-0121-03

李 琼，张爱华，郑 颖，等. 2种模式细菌对人参皂苷的化学趋向性响应[J]. 江苏农业科学，2017，45(2)：121-123.