拟微绿球藻生长条件优化

时间：2024-05-21

季祥，乔岩，成杰，刘鲜艳，赵昕宇，郑添慧，徐迪华，蔡禄

(1.内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010； 2.内蒙古自治区生物质能源化利用重点实验室，内蒙古包头 014010)

拟微绿球藻生长条件优化

季祥1，2，乔岩1，成杰1，2，刘鲜艳1，赵昕宇1，2，郑添慧1，徐迪华1，蔡禄1，2

(1.内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010； 2.内蒙古自治区生物质能源化利用重点实验室，内蒙古包头 014010)

采用单因素试验和正交试验L16(45)，研究不同浓度的N、P、Fe、Mg以及维生素混合液对拟微绿球藻生长的影响。结果表明，拟微绿球藻最适生长的条件是f/2培养基中添加0.225 g/L NaNO3、0.015 g/L NaH2PO4·2H2O、0.018 9 g/L FeCl3·6H2O、0.025 g/L MgCl2，1 L维生素混合液体积为0.05 mL。

拟微绿球藻；矿质元素；维生素；正交设计；生长条件

拟微绿球藻是一类属于真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)，近似球形的单细胞真核生物[1]，具有较高的光合作用效率和油脂含量[2]，长速度快，适合作水生动物的饵料。藻中的多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等对水产动物的影响效果明显[3-5]。但由于拟微绿球藻易受环境和不同营养盐等多种条件的影响，其质量和产量不稳定。在生产过程中资金投入大，成本高，产量和生物量都较低。针对这种情况，本研究对拟微绿球藻的营养盐含量进行单因素试验和正交试验，旨在优化其生长条件，以使其能满足微藻现代化的大批量运用。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为拟微绿球藻，内蒙古自治区生物质能源利用重点实验室保存。

1.2 方法

采用f/2培养基为基本培养基，培养基配方为0.075 g/L NaNO3、0.005 g/L NaH2PO4·H2O；微量元素溶液是由4.16 g Na2EDTA、3.15 g FeCl3·6H2O、0.01 g CuSO4·5H2O、0.022 g ZnSO4·7H2O、0.01 g CoCl2·6H2O、0.18 g MnCl2·4H2O、0.006 g Na2MoO4·2H2O溶于去离子水中，并定容至 1 000 mL，每1 L培养基取1 mL；维生素混合溶液由0.1 g维生素B1、0.005 g维生素B12、0.005 g生物素溶于去离子水中，并定容至1 000 mL，每1 L培养基取1 mL。

培养基中分别添加NaNO3、NaH2PO4·2H2O、FeCl3·6H2O、MgCl2、维生素混合液，以考察不同浓度N、P、Fe、Mg和维生素混合液对藻生长影响。NaNO3浓度梯度分别为 0.019、0.038、0.075、0.150、0.225 g/L；NaH2PO4·2H2O浓度梯度分别为0.001、0.003、0.005、0.011、0.017 g/L；FeCl3·6H2O浓度梯度分别为0.000 79、0.001 57、0.003 15、0.006 30、0.009 45 g/L；MgCl2浓度梯度分别为1.245、2.491、4.981、9.962、14.943 g/L；维生素混合液加入体积梯度分别为0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mL/L。

为研究N、P、Fe、Mg和维生素混合液浓度对拟微绿球藻生长交互作用，采用5因素4水平正交设计，各因素水平如表1所示。

2 结果与分析

2.1 NaNO3浓度对拟微绿球藻生长的影响

氮源是藻类生长的限制因子之一。在藻细胞中，氮是控制光合作用的元素。当氮源不足时，光合作用减弱且有利于饱和脂肪酸的合成；但当氮源浓度过高时，微藻生长也会受到抑制，不利于饱和脂肪酸的合成[6-7]。硝酸盐一直是培养拟微绿球藻的一种普通氮源，不同藻类对氮源的需求量和敏感度不同。NaNO3浓度对拟微绿球藻生长的影响如图1所示。NaNO3在较低浓度时，由于缺少氮源，导致拟微绿球藻的生长缓慢。在一定范围内，随着NaNO3浓度的增加，其细胞数目呈上升趋势。相关分析表明，NaNO3浓度与拟微绿球藻生物量呈极显著正相关(P<0.01)，当NaNO3的浓度为 0.15 g/L 时，拟微绿球藻的D680 nm值最高，说明在此浓度下其细胞生长量最大，生长状况最佳。因此，NaNO3最适浓度为 0.15 g/L。

表1 拟微绿球藻生长环境因素优化L16(45)正交试验设计

2.2 NaH2PO4·2H2O浓度对拟微绿球藻生长的影响

磷元素是构成细胞膜、ATP、DNA和RNA的必需元素[8]，大多数藻类贮存磷源的方式为主动吸收[9]。本试验以NaH2PO4·2H2O作为磷源，对拟微绿球藻生长的影响，结果如图2所示。在一定范围内，NaH2PO4·2H2O浓度的增加，促进拟微绿球藻对磷的吸收，其细胞的内含物大量增加，细胞数目呈上升趋势。相关分析可知，NaH2PO4·2H2O浓度与拟微绿球藻生物量呈极显著正相关(P<0.01)，当NaH2PO4·2H2O的浓度为0.011 g/L时，拟微绿球藻的D680 nm值最高，此时磷对拟微绿球藻的影响最显著。

2.3 FeCl3·6H2O浓度对拟微绿球藻的生长影响

铁离子是构成藻细胞内一些氧化还原酶的辅基，并能以各种形式与蛋白结合，铁元素缺乏会影响藻类细胞的正常代谢[10]。FeCl3·6H2O对拟微绿球藻生长的影响，结果如图3所示。FeCl3·6H2O浓度较低时，拟微绿球藻细胞数目少，这是因为低浓度的铁不利于拟微绿球藻的代谢，随着铁浓度的增加，拟微绿球藻细胞数目在一定范围内呈上升趋势，当 FeCl3·6H2O浓度为0.006 3 g/L时D680 nm达到最大值，说明在此浓度下最适合拟微绿球藻生长。

2.4 MgCl2浓度对拟微绿球藻生长的影响

镁是构成叶绿素的必需元素，在叶绿素合成和光合作用中起着重要作用，应异常会影响藻类的生长[11]。MgCl2对拟微绿球藻生长的影响，结果如图4所示。MgCl2浓度与拟微绿球藻生物量呈极显著正相关(P<0.01)，当MgCl2在浓度为1.245～2.491 g/L测出的D680 nm值较高，且十分接近，随着MgCl2浓度不断增加，D680 nm值出现下降趋势。表明低浓度的镁离子促进拟微绿球藻的生长，高浓度对拟微绿球藻的生长起抑制作用。

2.5 维生素混合液浓度对拟微绿球藻生长的影响

维生素是影响微藻生长的重要因素之一。维生素混合液包括维生素B1、维生素B12和生物素。维生素B1是常用的藻类生长促进剂，维生素B12常作为催化甲基转移反应的酶的辅基。维生素混合液浓度对拟微绿球藻生长的影响结果如图5所示。1 L培养基维生素混合液的体积量在0.5 mL时，拟微绿球藻的D680 nm值相对较大，此时是维持微藻细胞生长的最佳条件。1 L 培养基维生素混合液的体积量在1～3 mL，拟微绿球藻D680 nm值下降幅度大，说明这个阶段的维生素混合液对微藻的生长有抑制作用。

2.6 5种营养盐浓度对拟微绿球藻生长影响相互作用和优化组合

由表2可知，5种因素对拟微绿球藻生长影响的主次顺序为B>A>D>E>C，可见B、A为影响藻细胞生长的主要因素，磷源的质量浓度水平对拟微绿球藻生长的影响最大，其次是氮源质量浓度水平对其生长的影响。通过分析5因素的均值可知，5种营养盐最优的水平组合为A2B2C4D2E1，即NaNO3浓度为0.225 g/L，NaH2PO4·2H2O浓度为 0.015 g/L，FeCl3·6H2O浓度为0.018 90 g/L，MgCl2浓度为0.025 g/L，1 L维生素混合液体积为0.05 mL。正交试验中NaNO3、NaH2PO4·2H2O的优化浓度与单因素试验的结果较吻合，而铁、镁、维生素混合液的最适浓度较单因素试验低。由于正交试验考虑了各因子的交互作用，因此后续试验均以正交试验的结果所得培养基配方进行藻体培养，以获得最大生物量。

表2 拟微绿球藻正交试验结果

2.7 优化后生长情况测定

拟微绿球藻在优化后的培养基与f/2培养基中的生长相比，拟微绿球藻在优化后的培养基中生长情况良好(图6)，优化后拟微绿球藻的生物量在第4天开始超过f/2培养基。

3 结论

采用单因素和正交试验，研究了NaNO3、NaH2PO4·2H2O、FeCl3·6H2O、MgCl2以及维生素混合液浓度对拟微绿球藻生长的影响。结果表明，拟微绿球藻最佳培养基配方为NaNO30.225 g/L、NaH2PO4·2H2O 0.015 g/L、FeCl3·6H2O 0.018 90 g/L、MgCl20.025 g/L，1 L维生素混合液体积 0.05 mL。优化后拟微绿球藻的最大生物量(D680 nm)可达1.544，是优化前的1.35倍。通过优化，提高了拟微绿球藻的生物量，可以满足微藻现代化的大批量生产。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.046

2015-12-04

内蒙古自治区自然科学基金(编号：2015MS0335)；内蒙古自治区教育厅自然科学重点项目(编号：NJZZ14162)；大学生创新基金(编号：2014026)。