氮肥减施对花生根际土壤固氮微生物多样性的影响

吴海宁 黄志鹏 唐秀梅 熊发前 钟瑞春 贺梁琼 韩柱强 蒋菁 刘菁 唐荣华

摘要：设置施氮N3（64 kg/hm2）、减量施氮N2（51 kg/hm2）、减量施氮N1（34 kg/hm2），不施氮N0共4个施氮水平，对花生单作、玉米花生间作体系中花生根际土壤样品运用Illumina MiSeq高通量测序技术测序并分析固氮微生物的多样性。结果表明，在单作花生根际土中固氮微生物的多样性和丰度随着氮肥的减施表现出升高的趋势，而在间作花生根际土中固氮微生物的多样性和丰度则随着氮肥的减施出现降低的趋势。对24个花生根际土壤样品进行测序分析得到，固氮微生物可操作分类单元（OTUs）在分类学门、科和属水平上可归类为8个门、29个科和37个属，其中在门水平上有3个优势类群，共占所有门的97.7%以上，分别为变形菌门（Proteobacteria）、细菌未分类门（p_unclassified_k_，norank_d_Bacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）。氮肥减施条件下固氮微生物群落结构在单作花生根际土壤中比较相似，在间作花生根际土壤差异较大。试验表明，氮肥减施有利于单作花生根际土壤固氮微生物的生长，增强固氮微生物相对土壤中其他微生物的竞争优势，提高固氮微生物的多样性和丰度。而氮肥减施不利于间作花生根际土壤固氮微生物的生长繁殖，降低了间作花生根际土壤固氮微生物的多样性和丰度。

关键词：氮肥减施;花生根际土;固氮微生物;多样性

中图分类号： S154.3  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0093-04

收稿日期：2018-05-07

基金项目：国家自然科学基金（编号：31660371）;广西科技开发项目（编号：桂科转1599004-12）;现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS-13-华南区栽培）;广西自然科学基金（编号：2017GXNSFAA198144）;广西农业科学院科技发展基金（编号：桂农科2017JM18）。

作者简介：吴海宁（1986—），男，广西扶绥人，硕士，助理研究员，主要从事花生栽培与育种研究工作。

通信作者：唐荣华，博士，研究员，主要从事花生高产高效栽培与育种研究工作。

氮素是植物不可或缺的营养元素，是提高作物产量的重要限制因子。但是过量施用氮肥会对土壤环境造成损害，也会对农田土壤微生态造成影响。近年来人们开始关注氮肥的施用以及土壤养分的转化和循环。生物固氮是农田生态系统中土壤氮素的有效来源之一[1]，土壤中的固氮微生物能够将空气中的N2还原成NH3供植物根系吸收，是农田生态系统物质循环的主要途径之一[2]。土壤固氮微生物是根际土壤环境的重要组成部分，其群落多样性可以反映土壤微生态的代谢方式和生理功能[3]，群落结构组成能影响氮素循环的平衡与土壤氮素的固定，在土壤氮素循环中起着重要作用。因此研究氮肥减施和不同种植模式下土壤固氮微生物的群落结构差异，对建立合理的種植模式和土壤氮素循环利用具有重要意义。

花生是我国重要的油料作物与经济作物，是食用油和蛋白质的来源。为满足消费需求，我国花生的种植面积、规模、产量持续增长，同时也消耗了大量的化学肥料，影响土壤微生态环境。为可持续发展农业，减少对农业化学氮肥的依赖，花生与禾本科间作体系正越来越受到关注[4]。间作能增加农田生物的多样性和稳定性，提高土壤微生物量，改善农田土壤生态，促进农田生态系统平衡[5]，是农业可持续发展的重要栽培模式。

土壤固氮微生物含有编码固氮酶蛋白的nifH基因，该基因与16S rRNA的系统发育有着显著的相似性[6]，可以作为分子生物学研究土壤固氮微生物的靶标[7]。已有学者利用分子生物学方法对土壤、海洋、河流等生态环境进行研究，结果表明，不同的生态环境中含有固氮酶nifH基因的微生物群落多样性和结构具有显著的差异[8]。目前对单、间作花生在氮肥减施条件下根际土壤固氮微生物的研究鲜有报道。因此，本研究利用Illumina MiSeq高通量测序技术，探讨氮肥减施对单、间作花生根际土壤固氮微生物多样性及群落组成的影响，以期为花生生产中氮肥减施及花生与禾本科间作体系研究提供土壤固氮微生物方面的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的花生品种为桂花836、玉米品种为桂单0810。供试地点土壤理化性质：全氮、全磷、全钾含量分别为0.113%、0.053%、0.240%，水解性氮含量为88 mg/kg，有效磷含量为11.4 mg/kg，速效钾含量为110 mg/kg，有机质含量为 18.5 g/kg，pH值为7.1。

1.2 试验方案

试验于2017年3月在广西农业科学院武鸣里建科学研究基地进行，采用裂区设计，主区为种植模式，分别为花生单作、玉米花生间作，副区为花生施氮总量，共设置4个不同施氮水平，分别为常规施氮N3（64 kg/hm2），减量施氮N2（51 kg/hm2），减量施氮N1（34 kg/hm2），不施氮N0（对照），共8个处理，3次重复，每个小区面积为40 m2。每小区花生还需施用P2O5 67.5 kg/hm2、K2O 67.5 kg/hm2以及钙镁磷肥750 kg/hm2，玉米施肥模式为450 kg/hm2复合肥（N ∶P2O5 ∶K2O 含量百分比为15 ∶15 ∶15）作基肥，300 kg/hm2 复合肥和150 kg/hm2尿素（N含量为46%）作追肥。玉米、花生均采用宽窄行种植，规格相同，大行距55 cm，小行距35 cm，玉米株距为0.2 m，每穴1株，花生穴距为 0.16 m，每穴2株。间作采用4行玉米、6行花生的种植模式。

1.3 根际土壤样品的采集

于花生荚果膨大期采集各处理小区的花生根际土壤。将处理小区的花生植株拔起，轻轻抖落根部的表土后，用无菌毛刷将附着在根系表面1～4 mm的土壤刷入无菌离心管中，每小区取3份根际土壤，混合后作为该小区的根际土壤样品，保存于-80°冰箱，用于固氮微生物多样性的分析。

1.4 土壤固氮微生物多样性分析

1.4.1 土壤总DNA提取及PCR扩增

取0.5 g土壤样品，使用MP Bio公司生产的土壤基因组DNA提取试剂盒（FastDNA Spin Kit For Soil）进行土壤样品总DNA的提取与纯化，DNA浓度和纯度利用超微量分光光度计（Nano Drop2000）进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。

选用聚合酶链式反应（PCR）引物nifHF（5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′）和nifHR（5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′）对nifH基因进行扩增，体系为DNA聚合酶缓冲液（5×FastPfu）4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，10 ng DNA模板，補双蒸水（ddH2O）至20 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性3 min;95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;72 ℃延伸10 min（PCR仪为ABI GeneAmp 9700型）。

1.4.2 Illumina Miseq测序

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测;利用微型荧光计（QuantiFluorTM-ST）进行定量检测。根据高通量测序（Illumina MiSeq）平台标准操作规程对纯化后的扩增片段构建文库。

利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（委托上海美吉生物医药科技有限公司测序）。

1.4.3 数据处理

原始测序序列使用Trimmomatic软件进行质控，并用FLASH软件进行拼接;使用UPARSE软件（版本：version 7.1，网址：http：//drive5.com/uparse/）根据97%的相似度对序列进行分类单元（OTU）聚类;使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用核糖体数据库项目（RDP）分类器（网址：http：//rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，与FGR数据库中的固氮酶基因（nifH）进行比对，设置比对阈值为70%;运用I-Sanger生信云平台（网址：http：//www.i-sanger.com/）进行样本内多样性（Alpha）和样本间多样性（Beta）计算分析。

2 结果与分析

2.1 测序结果质量分析

运用高通量测序技术对24个花生根际土壤样品里的固氮微生物nifH基因进行测序分析，并对原始测序序列进行过滤、双端拼接，共获得优化序列347 174条，序列的平均长度为 430.67 bp。将优化序列按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，共得到OTU的代表序列1 228条，各土壤样品相关测序数据如表1所示。

稀释性曲线（rarefaction curve）通过序列数与物种数来构建，可以用于验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，也可以用来说明样本的测序数据量是否足以覆盖所有类群。从图1可以看出，各样品的序列数据量达到7 000条时，可操作单元数基本趋于饱和，表明测序获得了足够多的数据量，而且从表1可知，各样品测序覆盖度都在0.95以上，基本可以反映各土壤样品中固氮微生物的信息。

2.2 各样品中固氮微生物多样性指数分析

Chao1指数和Ace指数常用来衡量样品中微生物物种丰度即物种数量的多少，是生态学中估计物种总数的常用指数。Shannon指数和Simpson指数常用于衡量样品中微生物物种多样性，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，则说明样品中微生物群落多样性越高。从表2可以看出，单作花生N0、N1处理的Chao1指数、Ace指数、Shannon指数均分别大于N2、N3处理，单作花生N0、N1处理的Simpson指数均分别小于N2、N3处理，大体上看，单作花生根际土壤固氮微生物的多样性和丰度随着氮肥的减施基本上呈现出升高的趋势;除了Ace指数外，间作花生N0、N1处理的Chao1指数、Shannon指数均分别小于N2、N3处理，间作花生N0、N1处理的Simpson指数均分别大于N2、N3处理，大体上看，间作花生根际土壤固氮微生物的多样性和丰度随着氮肥的减施大致出现降低的趋势。说明在栽培单作花生时，减施氮肥能提高花生根际土壤的固氮微生物多样性和丰度，而间作花生则相反。

2.3 不同花生根际土壤固氮微生物的群落结构分析

24个花生根际土壤样品经测序检测得到，固氮微生物OTUs在分类学门、科和属水平上可归类为8个门、29个科和37个属。其中变形菌门（Proteobacteria）、细菌未分类门（p_unclassified_k_norank_d_Bacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）是门水平上的3个优势类群，其占比之和大于97.7%（图2）。在属分类水平上平均丰度大于1%的有16个属，其中主要的优势类群有变形菌门未分类属（unclassified_p_Proteobacteria）、根瘤菌目未分类属（unclassified_o_Rhizobiales）、α-变形菌纲未分类属（unclassified_c_Alphaproteobacteria）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、细菌未分类属（unclassified_k_norank_d_Bacteria）、地杆菌属（Geobacter）、厌氧黏细菌属（Anaeromyxobacter）、三离藻属（Trichormus）、产碱菌属（Azohydromonas）9个，其在所有土壤样品中平均相对丰度分别为35.4%、13.2%、11.1%、8.7%、7.9%、6.3%、3.6%、3.3%、1.5%（图3）。

在单作花生的根际土壤中，变形菌门未分类属（unclassified_p_Proteobacteria）、厌氧黏细菌属的相对丰度值随着氮肥的减施表现出先降低后再升高的趋势，均在N2水平下达到最低值。α-变形菌纲未分类属（unclassified_c_Alphaproteobacteria）、地杆菌属的相对丰度值均随着氮肥的减施呈现先升高后降低的趋势，前者达到最高值时在N2水平，后者则在N1水平。根瘤菌目未分类属（unclassified_o_Rhizobiales）的相对丰度值无明显的变化规律。慢生根瘤菌属的相对丰度值受氮肥减施影响不大。

在间作花生的根际土壤中，变形菌门未分类属（unclassified_p_Proteobacteria）、根瘤菌目未分类属（unclassified_o_Rhizobiales）、α-变形菌纲未分类属（unclassified_c_Alphaproteobacteria）、厌氧黏细菌属的相对丰度值是随着氮肥的减施均呈现出先降低后再升高的趋势，且都在N2水平下达到最低值。慢生根瘤菌属的相对丰度值随着氮肥的减施总体升高，在N0水平下达到最高值。地杆菌属、三离藻属的相对丰度值随氮肥的减施表现出先升高后降低的趋势。

在单、间作花生根际土壤中变形菌门未分类属（unclassified_p_Proteobacteria）、厌氧黏细菌属的相对丰度值随着氮肥的减施其变化规律基本一致。氮肥减施对单作花生根际土壤中慢生根瘤菌属的相对丰度值影响不大，但其能提高间作花生根际土壤慢生根瘤菌属的相对丰度值。

2.4 不同土壤样品固氮微生物的Venn图分析

由图4可知，在单作花生根际土壤中，单作花生N3、单作花生N2、单作花生N1和单作花生N0处理的总操作分类单元（OTU）数分别为839、767、961、911个，其共同包含的OTU有519个。单作花生N3特有的OTU数为32个，单作花生N2特有的OTU数为25个，单作花生N1特有的OTU数为61个和单作花生N0特有的OTU数为33个。从结果可以看出，不同施氮水平下的单作花生根际土壤所含的OTU数单作花生N1和单作花生N0分别大于单作花生N3和单作花生N2，说明单作花生氮肥減施可以提高其根际土壤中的固氮微生物类群数量。

在氮肥减施的间作花生根际土壤中，其共同包含的OTU有447个，间作花生N3、间作花生N2、间作花生N1和间作花生N0处理OTU数分别为902、857、891和738个。间作花生N3特有的OTU数为47个，间作花生N2特有的OTU数为31个，间作花生N1特有的OTU数为31个和间作花生N0特有的OTU数为37个。由此可以得出，不同施氮水平的间作花生根际土壤所含的OTU数间作花生N3和间作花生N2分别大于间作花生N1和间作花生N0，说明间作花生氮肥减施使其根际土壤中的固氮微生物类群数量减少。

2.5 不同土壤样品固氮微生物的群落结构的相似性分析

采用主坐标分析方法对8个不同处理组的花生根际土壤固氮微生物在属分类水平上进行分析，评估固氮微生物群落间的差异。从图5可以看出，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）对固氮微生物群落结构变异的解释量分别为70.70%和12.03%;单作花生根际土壤样品间的点距离比较近，说明它们的固氮微生物群落结构比较相似;而间作花生的根际土壤样品点比较分散，样品间距离较远，说明其根际土壤间的固氮微生物群落的构成差异较大。

3 结论与讨论

土壤固氮微生物是农田生态系统中参与土壤氮素循环利用的重要功能菌群，其群落结构的多样性对农田土壤微生态氮素的固持和循环利用具有重要的意义[9]。大量研究表明，农田长期施用氮肥会使得土壤固氮微生物的竞争力下降，从而导致其群落结构、组成和多样性的改变[10-12]。郑棉海等研究得出，土壤氮素含量变化会对固氮微生物与其他土壤微生物的竞争关系产生影响，同时也指出，在氮素缺乏的土壤中固氮微生物更具有竞争优势[13]。本研究表明，减施氮肥能提高单作花生根际土壤的固氮微生物多样性和丰度，提高其根际土壤固氮微生物类群数量，有利于固氮微生物的生长，这与周晶的研究结论相似：土壤施加氮肥会使固氮微生物的数量显著降低，并且氮肥水平越高，固氮微生物的数量越低[14]。而间作花生根际土壤固氮微生物的多样性和丰度则随着氮肥减施量的增加呈降低趋势，使根际土壤固氮微生物类群数量减少。导致单、间作花生根际土壤固氮微生物多样性和丰度随氮肥减施产生相反变化趋势的原因可能是，间作栽培体系比单作需要更多的氮肥来保证作物正常生长，而氮肥减施会减少土壤固氮微生物生长所需的营养，不利于微生物繁殖，同时间作栽培体系也改变了间作花生根际的土壤微生态环境，使得间作花生根际土壤温度、湿度等环境因子以及固氮微生物可以利用的碳氮营养、矿质元素发生了变化。

在本研究中，氮肥减施对单、间作花生根际土壤中的固氮微生物群落结构组成及多样性的影响并不完全一致。随着氮肥的减施两者中的变形菌门未分类属（unclassified_p_Proteobacteria）、厌氧黏细菌属的固氮微生物相对丰度值变化规律基本一致。氮肥减施对单作花生根际土壤中慢生根瘤菌属的相对丰度值影响不大，但其能提高间作花生根际土壤慢生根瘤菌属的相对丰度值。与单作花生根际土壤相比，间作花生根际土壤的地杆菌属（Geobacter）、三离藻属（Trichormus）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium ）的平均相对丰度分别提高了7.1%、2.9%、1.9%，变形菌门未分类属（unclassified_p_Proteobacteria）、α-变形菌纲未分类属（unclassified_c_Alphaproteobacteria）、根瘤菌目未分类属（unclassified_o_Rhizobiales）的平均相对丰度分别降低了 5.1%、3.3%、2.3%。

氮肥减施有利于单作花生根际土壤固氮微生物的生长，能够提高固氮微生物相对土壤中其他微生物的竞争优势，同时可提高了固氮微生物的多样性和丰度。而氮肥减施不利于间作花生根际土壤固氮微生物的生长繁殖，降低了间作花生根际土壤固氮微生物的多样性和丰度。

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