间歇浸没法和浸泡法诱导木薯多倍体

符芳宁 黄俞铭 李良香 冯斗

摘要：为了比较传统木薯浸泡法诱导多倍体和利用间歇浸没式生物反应器（TIBS）诱导木薯多倍体的效果，以木薯良种GR891无菌组培苗为材料，利用秋水仙素进行不同浓度、不同间歇浸没时间对木薯开展多倍体诱导试验，并对诱导的木薯增殖苗进行染色体鉴定和细胞解剖学等生理指标的测定。结果表明，利用TIBS进行诱导的木薯多倍体诱导率优于浸泡法，秋水仙素浓度为0.10 g/L、系统间歇时间为20 min/h时，处理4 d后木薯多倍体诱导率最高，为2333%;在系统间歇时间为10 min/h、秋水仙素浓度为0.05 g/L时，处理4 d后木薯多倍体诱导率最高，为26.67%。

关键词：木薯;TIBS;浸泡法;秋水仙素;诱导率

中图分类号： S533.043  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0112-03

收稿日期：2018-04-13

作者简介：符芳宁（1991—），男，海南琼海人，硕士研究生，研究方向为作物遗传育种。

通信作者：冯 斗，博士，教授，研究方向为（能源、热带）作物遗传育种与栽培及产业化。

木薯作为三大薯类作物之一，是全球第六大粮食作物，有着“淀粉之王”的美誉，是世界近6亿人口赖以生存的粮食[1]。广西作为我国最大的木薯产区，木薯的种植面积、鲜薯产量及木薯淀粉产量都处于全国首位，但是木薯平均产量较低。多倍体育种是重要的育种方法之一，尤其是利用块根为收获产品的木薯培育多倍体品种，其器官一般比原倍性植株有所增大，抗逆性也增强，同时淀粉含量也相对提高。因此，培育木薯多倍体品种是木薯高产稳产的有效途径。近年来对木薯多倍体诱导的研究屡见报道，但是利用间歇浸没式生物反应器（TIBS）诱导木薯多倍体的研究还很少。本试验采用不同浓度秋水仙素离体诱导木薯多倍体，并对浸泡法和TIBS法的诱导效果进行比较，以期为木薯多倍体诱导研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用的木薯优良品种为GR891，以经试验培养建立的无菌组培苗作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度秋水仙素在TIBS上对木薯多倍体诱导的影响

试验共设置5个不同浓度（0、0.05、0.10、0.20、0.50 g/L）秋水仙素处理，每个浓度接种30个芽，每个瓶子装6个芽，每个重复有5瓶。将接种好的芽放置到TIBS系统上进行诱导，TIBS设置2个不同的间歇浸没时间，分别为10、20 min/h。除0 g/L秋水仙素处理木薯芽节在诱导第6天后接种到继代培养基上外，其他浓度处理均在诱导第2、4、6天后接种到继代培养基上，培养45 d后统计结果。比较不同浓度秋水仙素在不同间歇时间TIBS上对木薯多倍体的诱导情况。

1.2.2 不同浓度秋水仙素在浸泡法下对木薯诱导的影响

试验共设置5个不同浓度（0、0.05、0.10、0.20、0.50 g/L）秋水仙素处理，选取在MS培养基中继代培养4～6周的木薯组培苗，将生长健壮的无菌苗切成单芽茎段，用不同浓度的秋水仙素进行诱导处理，除0 g/L秋水仙素处理时间为3 d外，其余处理时间均为1、2、3 d，处理完毕后用无菌水冲洗3～4次，切除茎段两边以防止秋水仙素残留，然后转接到新的MS培养基上继代培养，培养45 d后观察材料，并进行统计。每个浓度接种30个芽，每瓶接种6个芽，共5瓶。

成活率=（成活的植株数/接种的单芽茎段数）×100%;

誘导率=（变异的植株数/接种的单芽茎段数）×100%。

1.2.3 染色体鉴定 多倍体木薯苗和原倍性木薯苗在形态特征上有差异，将叶色浓厚、叶片较大、肥厚、叶片不规则、茎秆粗壮、根系粗壮的组培苗筛选出来进行染色体鉴定。将诱导完成后的木薯茎段芽继代培养在新鲜的培养基中，经过2代培养后先初步进行植株的形态学差异判断，选出可能诱导成功的植株，然后根尖镜检统计变异芽数。首先，预处理参考王超等的方法[2]，具体操作为：用滤纸吸干用蒸馏水洗净的根尖，放入0.10 g/L秋水仙素和0.002 mol/L 8-羟基喹啉混合溶液（体积比为1 ∶1）中，室温下预处理2 h，用卡诺氏固定液固定24 h后，用蒸馏水清洗3遍，再用50%乙醇清洗1遍，最后放入70%乙醇中于4 ℃冰箱中保存。参考冯斗等的方法[3]进行染色体数鉴定。在温度为（60±1） ℃的恒温水浴锅中用 1 mol/L HCl溶液处理根尖13 min。处理完成后，取出根尖，用蒸馏水清洗3遍去除盐酸残留液，然后浸入蒸馏水中30 min后，取出放在滤纸上吸干水分，然后放在载玻片上，用刀片切去根尖分生组织保留1.0～1.5 mm长，滴1滴改良苯酚品红染液，染色1～2 min，盖上盖玻片，用铅笔先挤压根尖，然后轻轻敲击盖玻片，使材料分散均匀。

1.2.4 多倍体和二倍体解剖学比较 对木薯二倍体和多倍体的保卫细胞和气孔形态进行比较，同时比较木薯叶片横截面。

1.2.5 木薯块根所含淀粉量的测定和不同倍性的叶绿素含量比较 对诱导的多倍体木薯进行大田移栽，测定大田木薯的收获指数和块根淀粉含量。

2 结果与分析

2.1 不同浓度秋水仙素在不同TIBS上对木薯多倍体诱导的影响

由表1可知，当TIBS系统间歇时间设置为20 min/h时，随着秋水仙素浓度的增大，带芽茎段整体的成活率明显降低，在处理浓度提升至 0.50 g/L 时，外植体所对应的成活率达到极小值。在处理浓度为0.10 g/L时，处理4 d后其诱导率达到极大值，为23.33%。由表2可知，在TIBS系统间歇时间设置为10 min/h时，在浓度为0.05 g/L秋水仙素处理4 d时木薯GR891多倍体诱导率达到最大值，为26.67%。

2.2 不同浓度秋水仙素在浸泡法下对木薯多倍体诱导的影响

由表3可知，随着秋水仙素浓度的不断增大，带芽茎段整体成活率明显减少，在处理浓度提升至0.50 g/L时，外植体所对应的成活率达到极小值。在浓度为0.05 g/L秋水仙素处理2 d时，木薯GR891多倍体诱导率达到最大值，为16.67%。

2.3 诱导的木薯增殖苗多倍体和二倍体解剖学比较

从表4、表5可以看出，木薯多倍体的保卫细胞比二倍体的显著增大，保卫细胞内的叶绿体数目也比二倍体多，由于保卫细胞的增大，在相同面积内的气孔密度减少。在木薯叶片横截面观察（图1）中，多倍体的上下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度都比二倍体显著增大。总体上，叶厚比二倍体约增厚35.82%。

2.4 诱导的木薯增殖苗叶绿素、淀粉含量测量结果

如表6所示，木薯多倍体的叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量都显著多于二倍体，其中叶绿素a的含量比二倍体多62.56%，叶绿素b的含量比二倍体多 12.50%，说明多倍体植株的光合作用强于二倍体。此外，多倍体叶绿素含量增加也体现在多倍体叶片颜色加深上。木薯多倍体的淀粉含量显著低于二倍体，下降了7.12%。

2.5 诱导的木薯增殖苗染色体鉴定

由图2可知，经过秋水仙素处理后，木薯二倍体加倍成多倍体。

3 结论与讨论

本研究中，在TIBS系统诱导下，秋水仙素浓度为0.10 g/L、间歇时间为20 min/h时，处理4 d后木薯GR891多倍体诱导率达到最高值，为23.33%;在间歇时间为10 min/h、秋水仙素浓度为0.05 g/L时，处理4 d后木薯GR891多倍体诱导率最高值，为 26.67%。

秋水仙素对腋芽有毒害作用，由于使用浸泡法结合摇床振荡处理，使材料与秋水仙素充分接触，对材料危害较大，而利用TIBS诱导，木薯外植体与材料能间歇接触，对材料危害较小，成活率也提高，从而可能提高外植体的变异率。胡燕花等利用間歇浸没式生物反应器培养铁皮石斛种苗，结果发现，利用TIBS系统培养的铁皮石斛增殖率更高[4]。许建民等采用间歇浸没法培养马铃薯夏泊蒂，营养间歇浸没马铃薯组培苗生长最佳[5]。

本试验仅设计了2个不同TIBS系统间歇时间，其他最适时间有待研究，另外诱导浓度的设置可以降低。

利用TIBS在处理浓度和诱导时间上提高木薯诱导率仍需要继续试验。

参考文献：

[1]严华兵，叶剑秋，李开绵. 中国木薯育种研究进展[J]. 中国农学通报，2015，31（15）：63-70.

[2]王 超，王婧菲，庄南生，等. 木薯根尖染色体制片方法的优化[J]. 热带作物学报，2012，33（4）：627-630.

[3]冯 斗，王建岭，席世丽，等. 木薯根尖染色体的观察技术[J]. 安徽农业科学，2008，36（9）：3711-3712.

[4]胡燕花，张本厚，贾明良，等. 间歇浸没式生物反应器培养铁皮石斛组培苗[J]. 中国农业科技导报，2016，18（3）：190-194.

[5]许建民，王永平，王 宇. 马铃薯组培苗液体间歇浸没培养初探[J]. 江苏农业科学，2013，41（1）：53-55.