椰子织蛾CSP基因的克隆与序列分析

袁远　高熹　喜超　杨志新　雷腾云　张连根　朱家位

摘要：利用rapid-amplification of cDNA ends（RACE）技术，克隆获得了1条椰子织蛾（Opisina aremosella）的全长化感蛋白基因序列。该基因全长为561 bp，开放阅读框全长为393 bp，3′和5′端非编码序列分别为48、120 bp，编码130个氨基酸，所编码蛋白质的理论分子量为14.8 ku，等电点為5.85。同源性比对分析发现，椰子织蛾化感蛋白基因氨基酸序列有4个保守半胱氨酸位点且与其他昆虫化感蛋白基因在氨基酸的水平上相似性不高。除与棉红铃虫（Pectinophora gossypiella）相似度达71%外，与其他昆虫相比，均低于10%。SignalP预测显示，椰子织蛾化感蛋白基因所编码的前20个氨基酸为信号肽序列（MAMKYLIVLSCVLAAAIVAG）。系统进化树分析结果表明，椰子织蛾化感蛋白与稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和家蚕（Bombyx mori）化感蛋白1、2、3、4聚为同一族，与家蚕化感蛋白1、2、3、4的进化程度最近。这为深入研究昆虫化学感受蛋白、揭开昆虫与环境化学信息联系的规律奠定理论基础。

关键词：椰子织蛾;化感蛋白;基因克隆;序列分析;系统进化树

中图分类号： S433.4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）03-0043-03

高度发达的化学感受系统对昆虫与环境中的化学信息联系具有重要作用。昆虫在长期进化过程中，发展演变出复杂的化学信息感受机制。例如，在觅食、寻偶、产卵等行为中，通过敏锐的嗅觉、味觉、触觉等功能，感受各种环境化学因子的刺激，从而进行精巧的化学通信，以适应环境选择，保持种群繁衍[1]。昆虫发达的化学感受系统功能的发挥是基于昆虫各种感器淋巴液中分布着大量的化学感受蛋白（chemosensory proteins，简称CSPs）和气味结合蛋白（odorant-binding proteins，简称OBPs）。环境中的气味分子与各种嗅觉相关蛋白结合后，被运送至嗅觉神经末梢，从而引发以嗅觉功能为主的各种化学感受反应[2-3]。自1994年McKenna等首次在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）触角中发现2种与传统的气味结合蛋白无论在结构还是在功能上都有明显差别的蛋白后，研究者们随后相继又在多个目的昆虫如双翅目、直翅目、半翅目、膜翅目、鳞翅目、鞘翅目、脉翅目等中鉴定了大量编码CSP的基因[4-6]。由于此类蛋白主要存在于昆虫各种化学感受器，与感受环境化学刺激有关，所以又称之为昆虫化学感受蛋白（chemosensory protein，简称CSP）。CSP种类具有多样性，表达部位也不仅仅局限于感受器官，昆虫CSP在身体各部分的表达分布具有全面性，种类具有多样性，种间种内分布具有普遍性，而且在雌雄虫中均有表达，这些特点易于适应接受复杂的环境化学刺激信息，承担复杂的化学感受功能[7]。CSP在昆虫行为中扮演着重要角色，故对其进行深入研究，这不仅能阐明昆虫化学感受蛋白的作用机制，更有助于深入解析昆虫与环境信息交流本质，为进一步开拓害虫防治和益虫利用新途径提供了重要基础。

目前，有关昆虫化学感受蛋白的研究主要集中于一些较常见的农业害虫，如烟粉虱、棉花粉蚧、西花蓟马等。对于椰子织蛾化感蛋白基因的研究相对来说就很少了，但其危害性却不容忽视。2013年8月，我国首次在海南省万宁市兴隆镇华侨农场的椰林中发现椰子织蛾（Opisina aremosella Walker），风险分析表明，该虫在我国属于高度危险性有害生物，风险值（R值）达2.20[8]。鉴于椰子织蛾危害的严重性，于2014年被国家林业局列为林业危险性有害生物[9]。目前，国内对椰子织蛾的基因研究较少，仅有关于形态特征、生物生态学及生物防治方面的介绍性报道[10-11]。因此，本研究对椰子织蛾的化感蛋白进行克隆和序列分析，旨在探索椰子织蛾感知外界环境化学信号的作用机制，为今后对该虫防治提供新思路和新途径、研究昆虫与环境之间信息联系的本质规律奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 试虫

椰子织蛾于2016年采自海南椰子树，于云南农业大学实验室以香蕉叶片为寄主培养，待羽化至成虫收集作为试验材料。

1.2 总RNA的抽提

总RNA的抽提采用TRIZOL试剂盒（Invitrogen）提取。

1.3 RACE

以新鲜抽提的椰子织蛾总RNA为材料，利用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，合成3′和5′ RACE cDNA模板，以合成的cDNA为模板，参照RACE试剂盒说明书克隆该基因的5′端和3′端序列。PCR采用Advantage 2 PCR kit（Clontech）。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2.5 min，循环40次;72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖检测PCR扩增结果，对目的条带进行切胶回收后并纯化。用TA克隆法连接pGEM-T-easy载体（Promega），转化宿主菌为DH5α。在X-Gal和IPTG的存在下，经蓝白斑筛选，挑阳性克隆于金思特科技（南京）有限公司测序。

1.4 序列分析

核苷酸序列的翻译和氨基酸序列的比对分析分别使用GENETYX-MIN 5.1和ClustalX 1.83软件[12]，蛋白信号肽的预测使用SignalP在线分析工具[13]，结构域预测采用M Motifscan[14]，分子系统树的构建采用MEGA 4.0进行[15]。

2 结果与分析

2.1 cDNA克隆及序列分析

将3′和5′ RACE扩增所得目的基因片段进行拼接，共得椰子织蛾化感蛋白基因的全长序列为561 bp，开放阅读框全长为393 bp，命名为OarCSP（图1）。3′和5′端非编码序列分别为48、120 bp，该基因编码130个氨基酸，预测分子量和等电点分别为14.80 ku和5.85。SignalP预测显示，该蛋白的前20个氨基酸为信号肽序列（MAMKYLIVLSCVLAAAIVAG）。结构分析表明，OarCSP氨基酸序列中潜在1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（TGCE72-75）、2个N-豆蔻酰化位点（GQKYTD20-25和GCEKCT73-78）、2个蛋白质激酶C磷酸化位点（TDK24-26和TPR121-123）和1个酪氨酸激酶磷酸化位点（TGK110-112）。

2.2 同源性比较和进化分析

应用ClustalX对OarCSP与其他昆虫化感蛋白的氨基酸进行序列比对。由图2可知，OarCSP氨基酸序列具有4个保守半胱氨酸位点，与鳞翅目其他昆虫相似性不高，其中与棉红铃虫（Pectinophora gossypiella）、桃蛀螟（Conogethes punctiferalis）、茶尺蠖（Ectropis obliqua）、稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）和菜粉蝶（Pieris rapae）的相似性分别为71%、5%、9%、6%、8%。应用MEGA 4.0邻接法（neighbor-joining，简称NJ）对OarCSP与鳞翅目其他昆虫CSP氨基酸序列进行分子进化分析，构建NJ进化树（图3）。结果显示，鳞翅目夜蛾科、蚕蛾科、螟蛾科的化感蛋白聚为2个族，OarCSP与化感蛋白OfurCSP、CmedCSP1、BmorCSP1、BmorCSP2、BmorCSP3、BmorCSP4同源性高，聚为一族。

该分析所用20个鳞翅目昆虫化感蛋白的GenBank登录号如下：HassCSP[烟青虫（Helicoverpa assulta）]，ABB91378.1;OfurCSP[亚洲玉米螟（O. furnacalis）]，BAV56805.1;CmedCSP1[稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）]，AIX97823.1;CmedCSP2，ALT31606.1;MbraCSP[甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae）]，AAF71289.1;MsepCSP[黏虫（Mythimna separata）]，JAV45867.1;AipsCSP1[小地老虎（Agrotis ipsilon）]，AGR39577.1;AipsCSP2，AAP57460.1;AdisCSP（Athetis dissimilis），ALJ93810.1;SexiCSP[甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）]，AKT26484.1;HarmCSP1[棉铃虫（Helicoverpa armigera）]，AAK53762.1;HarmCSP2，AFR92097.1;CaurCSP[台湾稻螟（Chilo auricilius）]，AIU68827.1;HzeaCSP[美洲棉铃虫（Helicoverpa zea）]，AAN63675.1;BmorCSP1[家蚕（Bombyx mori）]，NP_001037052.1;BmorCSP2，AAV34688.1;BmorCSP3，AFF18000.1;BmorCSP4，AFD97753.1;SlitCSP[斜纹夜蛾（Spodoptera litura）]，ALJ30219.1。

3 结论与讨论

在研究昆虫对环境化学因子刺激感受机制的过程中，起初的研究重点是对气味的感受机制，昆虫化学感受蛋白的研究源于对昆虫气味结合蛋白的研究。然而，人们发现昆虫对环境化学因子刺激的许多行为反应并不能用气味结合蛋白和气味感受机理来解释，直到20世纪90年代CSP的发现，才为昆虫对环境化学因子刺激感受机理开辟了新的途径。本研究利用RACE技术，从椰子织蛾中克隆获得1个CSP基因，根据其cDNA序列推导的氨基酸序列表明，OarCSP具有昆虫化感蛋白的典型特征：相对分子量小，为14.80 ku，N-端存在20个氨基酸左右的信号肽，具有4个保守的半胱氨酸位点和典型的化感蛋白结构域，这体现了不同昆虫化感蛋白在进化过程中的保守性。通常，每一种昆虫中都存在多个化感蛋白基因，特别是近年来随着基因组学的迅猛发展，许多化感蛋白已迅速地从昆虫基因组中被发掘，如从黑腹果蝇、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、意大利蜜蜂和家蚕的基因组中分别获得4、8、6、22个化感蛋白基因，且有假基因的存在。同时还发现，CSP编码基因数目在各昆虫物种中都少于化学感受受体（OR或GR）和OBP编码基因数，还有很多化感蛋白没有被发现[16]，据此可知，更多的椰子织蛾化感蛋白基因有待克隆获得。多序列同源性分析表明，OarCSP与同目的昆虫相似性均较低，这主要是因为迄今化感蛋白仅在家蚕、小地老虎、棉铃虫、烟青虫等少数鳞翅目昆虫中报道，尤其是在织蛾科鲜有报道的缘故。此外，这体现了不同昆虫物种在生物演变过程中化感蛋白的进化现象，也反映了不同昆虫之间化感行为的多样性，这可能是不同昆虫在适应不同环境中接受复杂化学信息刺激的进化结果。经分子进化分析发现，OarCSP与化感蛋白OfurCSP、CmedCSP1、BmorCSP1、BmorCSP2、BmorCSP3、BmorCSP4聚为同一族，表明它们应为同一家族，尤其是OarCSP與家蚕化感蛋白BmorCSP1、2、3和4的进化程度最近，它们之间的组织表达分布、生理功能等应相似。

昆虫与环境之间的化学通信对于昆虫生存和繁殖至关重要，昆虫CSP遍布几乎所有感受器，起到感受、溶解、运输、传导环境化学刺激因子的作用[17]。其对昆虫感知外界化学环境的变化具有关键作用。通过研究CSP开发害虫产卵忌避剂等“昆虫行为防治剂”，以及益虫利用新技术等一直是国内外研究的热点和目标。通过掌握昆虫对环境化学刺激的分子感受机制，阐明昆虫行为反应的本质，有利于提高益虫利用和害虫治理效率。但要明确昆虫化学感受蛋白的化学信息转换、信号传导过程，还要对昆虫化感蛋白进行深入研究，才能为防治害虫和利用益虫提供新思路和新途径。本研究克隆获得椰子织蛾气化感蛋白OarCSP的基因全长序列，为深入研究昆虫化学感受蛋白，揭开昆虫与环境化学信息联系的规律奠定理论基础。

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