濒危植物蒙古扁桃SRAP反应体系优化

白羽　丁海麦　石松利

摘要：为利用SRAP技术研究蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定，利用正交试验法L16（45）正交设计，对影响蒙古扁桃SRAP-PCR反应体系的Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度4个因素以及模板DNA浓度进行筛选。优化的蒙古扁桃SRAP-PCR最佳反应体系为Mg2+浓度为2.5 mmol/L，dNTPs浓度为 0.25 mmol/L，模板DNA浓度为100 ng，Taq酶浓度为2.00 U，引物浓度1.0 μmol/L，2.5 μL 10×PCR buffer，总体积为25 μL。筛选结果表明，对蒙古扁桃SRAP-PCR扩增结果影响最大的是Taq聚合酶浓度，最小的是dNTPs浓度。运用该体系对144个随机SRAP引物组合进行筛选，筛选出12个条带清晰、多态性高的引物组合，为蒙古扁桃种质资源的研究奠定了基础。

关键词：蒙古扁桃;分子标记;SRAP;正交试验;反应体系;优化

中图分类号： S567.1+90.24  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）03-0046-03

蒙古扁桃是蔷薇科李属的多年生木本植物[1]，是传统的中药材，种仁可入药，主治干咳、阴虚便秘等病症。蒙古扁桃为亚洲中部戈壁地区特有的旱生种类，分布于我国的戈壁荒漠草原区[2]，是国家三级保护植物[3]。近年来蒙古扁桃的研究主要体现在生理[4-5]、药理性[6-7]、组织培养[8-10]、有效成分鉴定分离[11-13]等方面，但对于蒙古扁桃资源的遗传多样性研究和种质资源鉴定仍不多。

相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，简称SRAP）是一种以PCR标记技术为基础的分子标记技术，该技术重复性高、简便、快速，以广泛应用于药用植物的种质资源鉴定、遗传多样性研究、指纹图谱和亲缘关系等方面的研究。本研究利用正交试验设计对蒙古扁桃SRAP-PCR反应体系进行了优化，分析SRAP-PCR反应体系中各因素的相互影响[14]，得到最佳优化的组合，并对144对引物进行了SRAP-PCR分子标记，筛选一些多态性高的引物组合，为进一步研究蒙古扁桃种质资源和遗传多样性打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 材料 所选材料为蒙古扁桃的种仁，采集于阿拉善诺日公。

1.1.2 试剂 Taq DNA聚合酶，CTAB，MgCl2，dNTPs，10×PCR Buffer（Mg2+free），参照Li等发表的SRAP引物[15]设计12条正向引物、12条反向引物，均由上海生工生物技术服务有限公司合成;離心机（飞鸽，上海安亭科学仪器厂）;微量紫外可见分光光度计（Nano Drop）;凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）;PCR仪（Biometra公司）;电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取及检测 以蒙古扁桃的种仁为材料，利用改良的CTAB法提取基因组的DNA，DNA干燥风干后溶解沉淀于1×TE溶液中，并采用微量紫外分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳检测供试DNA的纯度和浓度。

1.2.2 SRAP-PCR体系的优化 利用L16（45）正交设计PCR反应试验，对DNA模板浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度和dNTP浓度，进行5因素4水平筛选（表1）。

1.2.3 SRAP-PCR扩增程序 制备总体积为25 μL的SRAP-PCR反应体系，除表中变化因素外，每管中加入10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，其余的补加ddH2O。模板为采集于赵长城的蒙古扁桃种仁DNA，所选用的引物组合为F5+R7，引物序列见表2。SRAP-PCR扩增程序：94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min30 s，5个循环;94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，35个循环;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。扩增反应在PCR仪上进行，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察并拍照。依照条带多少及条带强弱做1～16积分，分数越高，表明特异性、敏感性好。

1.2.4 优化体系的检测 根据以上试验结果确定SRAP-PCR的最佳反应体系，从预筛选引物中随机选取引物组合，对5个不同居群的样品DNA进行SRAP扩增，检测优化的SRAP-PCR体系及扩增程序的稳定性。

1.2.5 引物筛选 根据SRAP的正向引物12条，反向引物12条，随机组成144对引物组合，采用优化的SRAP-PCR组合，对采集于赵长城地的蒙古扁桃进行PCR扩增，扩增产物用1.5%琼脂糖检测，从而选择出多态性高的引物。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取

利用改良的CTAB法提取蒙古扁桃种仁DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳30 min，结果显示DNA条带清晰，无降解，表明DNA完整（图1）。通过紫外分光光度计对蒙古扁桃种仁DNA样品浓度进行检测，D260 nm/D280 nm比值在1.80～1.95之间，说明经改良的CTAB法提取DNA的提取质量较高，满足PCR的要求。

2.2 SRAP-PCR反应体系的正交优化设计

正交试验电泳结果见图1，根据主要条带的多少、清晰度打分，效果最佳16，最差的1分，各体系得分依次为1、12、14、4、2、6、6、8、2、1、15、15、2、16、3、14。从电泳结果可以看出，第3、11、12、14泳道的主条带清晰且多，副条带明显，表明这几个组合多态性高，都可以作为蒙古扁桃正交试验组合，但从经济性考虑，最后选择第3组作为蒙古扁桃SRAP-PCR最佳反应组合。直观分析12个组合的条带数，5因素间各水平具有不同显著性，对扩增效果的影响顺序依次为Taq DNA聚合酶>引物>Mg2+>模板DNA>dNTPs。即在25 μL体系中，2.00 U/mL Taq酶，1.0 μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2、0.25 mmol/L dNTPs、100 ng模板DNA是最佳反应体系。

2.3 体系优化稳定性的检测

根据上述正交试验设计优化的SRAP-PCR反应体系，利用F6/R9引物组合，对5份不同种质材料的DNA进行PCR扩增的结果见图2，条带清晰且多，特异性强，能够区分5种蒙古扁桃种质，表明该试验优化的SPAP-PCR反应体系能够有效地用于蒙古扁桃遗传多样性分析和种质资源鉴定等方面。

2.4 多态性引物组合的筛选结果

应用优化后的SRAP反应体系，用12条上游引物、12条下游引物组成的144对引物组合对蒙古扁桃样品进行PCR扩增，并筛选多态性好、条带清晰、重复性好的结果进行分析。最终从144对引物中筛选出12对多态性好、条带清晰的引物组合，分别为F1/R22、F2/R22、F3/R6、F4/R7、F5/R7、F6/R9、F7/R9、F8/R6、F9/R5、F10/R3、F11/R3、F12/R7。检测结果如图3所示。

3 讨论与结论

SRAP是一种新型的基于PCR反应的分子标记，不但具有扩增稳定、多态性强，而且还快速简单、重复性好。然而，反应体系中各因素水平浓度不同会对SRAP分子标记的结果产生影响，并且不同的植物对SRAP-PCR反应体系的要求也各不相同[16]。正交试验设计优化体系与传统的单因素体系优化方法相比，优点在于考虑到了试验中各反应条件间的相互影响，能迅速找到理想中的引物组合。因而，对体系的优化是进行SRAP反应的关键。正交优化设计一般采用的主观打分手段，易造成结论偏差，本试验利用了凝胶成像系统Gel-Pro Analyzer4图像处理软件，对SRAP-PCR建立起客观的评价标准，更好地促进正交优化的应用。

本试验建立的适合蒙古扁桃的SRAP反应体系为模板DNA浓度为100 ng，Mg2+浓度为2.5 mmol/L，Taq酶浓度为2.00 U，引物浓度1.0 mmol/L、dNTPs浓度为0.25 mmol/L，2.5 μL 10×PCR buffer，剩余用ddH2O补齐至25 μL。同时，本试验利用该体系从随机组成的144对引物组合中筛选出12对扩增产物多态性高、条带清晰的引物组合，为后续研究蒙古扁桃种质资源奠定了基础，也为用SRAP分子标记法研究蒙古扁桃种质遗传多样性、亲缘关系等方面提供了依据。

参考文献：

[1]斯琴巴特尔. 蒙古扁桃[J]. 生物学通报，2003，38（8）：23-24.

[2]傅立国. 中国植物红皮书[M]. 北京：科学出版社，1991.

[3]马 骥，倪细炉，史宏勇，等. 蒙古扁桃的开花生物学研究[J]. 西北植物学报，2010，30（6）：1134-1141.

[4]邹林林，红 雨，任国学. 濒危植物蒙古扁桃和柄扁桃種子萌发率和幼苗生长比较研究[J]. 内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版），2008，37（6）：791-794.

[5]斯琴图雅. 土壤干旱胁迫对蒙古扁桃种子及根系生理活动的影响[D]. 呼和浩特：内蒙古师范大学，2007：6.

[6]王登奎，石松利，程向晖，等. 蒙古扁桃对高脂血症大鼠血清脂质过氧化的影响[J]. 时珍国医国药，2013，24（3）：625-626.

[7]赵云山，吴培赛，张慧文，等. 蒙古扁桃药材正丁醇提取物降血脂作用的量效关系化学成分的研究[J]. 食品工业科技，2017，38（3）：348-352.

[8]杨开恩，孙建忠，杨雪梅. 蒙古扁桃种子育苗技术和幼苗生长过程[J]. 甘肃科技，2011，27（22）：160-162.

[9]方海涛. 蒙古扁桃水浸提液对几种植物种子萌发的影响[J]. 安徽农业科学，2010，38（2）：682-683.

[10]刘建泉，王 零，王多尧，等. 濒危植物蒙古扁桃种子的形态与萌芽过程及成苗生长状态的研究[J]. 西部林业科学，2010，39（1）：36-42.

[11]石松利，白迎春，程向晖，等. 蒙古扁桃药材中总黄酮提取及含量测定[J]. 包头医学院学报，2012，28（1）：12-13.

[12]刘慧娟，刘桂香，刘果厚，等. 蒙古扁桃种仁油理化性质及脂肪酸组成分析[J]. 中国油脂，2016，41（8）：98-101.

[13]白万富，石松利，郑倩男，等. 不同产地蒙古扁桃叶中槲皮素含量的比较研究[J]. 西部中医药，2016，29（3）：30-32.

[14]张 捷，李勤霞，张 萍，等. 新疆野核桃SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选[J]. 江苏农业科学，2016，44（3）：64-66.

[15]Li G，Quiros C F. Sequence-relatedamplified polymorp hism（SRAP），new marker system based on a simple PCR reaction：its app lication to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455-461.

[16]郑轶琦，王志勇，郭海林，等. 正交设计优化假俭草SRAP-PCR反应体系及引物筛选[J]. 草业学报，2008，17（4）：110-117.綦 洋，王柬钧，桑园园，等. 大白菜YUCCA基因家族的鉴定与生物信息学分析[J]. 江苏农业科学，2019，47（3）：49-54.