叶面喷施硒对萝卜硒吸收及抗氧化能力的影响

朱磊　胡婷　刘德明　向昌国

摘要：以华灵高科笋都四季满身红萝卜为试验材料，采用盆栽试验，设置6个施硒组分（0、0.5、2.5、10.0、20.0、40.0 mg/L）分别在叶旺盛生长期、块根膨大期、成熟期叶面喷施亚硒酸钠，研究叶面施硒浓度对萝卜生长、硒吸收和转化、硒形态分布以及对萝卜抗氧化能力的影响。结果表明，2.5 mg/L硒处理提高了萝卜果实产量，40.0 mg/L硒处理对萝卜果实生长具有抑制作用。随着叶面施硒浓度增加，萝卜叶子和果实中硒含量显著增加，且含量最高分别达到637、0.63 mg/kg。硒在萝卜叶子中主要以硒代蛋氨酸（SeMet）形式存在，含量为1.51 mg/kg;萝卜果实中硒主要以硒代胱氨酸（SeCys2）存在，含量为0.29 mg/kg。与对照组相比，2.5 mg/L处理组谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性增加了106.26%（P<0.05），过氧化物酶（POD）活性增加了14.87%（P<0.05），超氧化物歧化酶（SOD）活性无显著变化。适宜浓度的外源施硒能够增加萝卜产量、提高萝卜硒含量和增强抗氧化能力。因此，叶面施硒浓度2.5 mg/L为萝卜最佳施用量。

关键词：亚硒酸钠;萝卜;硒形态;抗氧化能力;叶面喷施

中图分类号： S631.106  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）03-0127-05

硒是人体所必需的微量元素之一[1]，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、增强人体免疫力和拮抗重金属等生理功能[2-4]。人体缺硒会导致多发性硬化症、肌肉萎缩症、心脏病、免疫系统受损、癌症和生殖系统疾病等[5]。全球约有29个国家存在缺硒现象[6]，我国有约72%的地区属于缺硒地区，约7亿人口有着不同程度的硒摄入量不足的情况[7]。中国营养学会规定成年人膳食硒摄入量最少为40 μg/d，可耐受最大量为 400 μg/d[8]。

硒不是高等植物所必需的微量元素，但适宜浓度的硒能促进植物生长[9]。适宜浓度的外源施硒能够促进十字花科植物生长，提高产量，硒浓度过高会对植物产生毒害作用，抑制植物生长[10-12]。这可能是适宜浓度补硒增加了植物对硫元素的的吸收转运、抗氧化活性，减少了脂质过氧化和食草性昆虫对植物的迫害[13-15]。硒对植物的毒域范围取决于物种和环境，影响植物吸收硒能力的主要因素是基因遺传其次是非生物因素，如环境条件（微生物群落）和硫、氮等元素之间的相互作用[16]。硒能够参与合成硒代半胱氨酸且是一些硒蛋白酶的活性中心[17]。谷胱甘肽过氧化物酶能够通过降低过氧化氢、有机氢过氧化物、磷脂有机过氧化物含量来增强植物抗氧化能力[18]。研究发现，适宜浓度外源硒能够提高植物谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性从而增强植物的抗氧化能力，防止细胞氧化损伤[19-21]。

近年来，以植物为基料作为富硒源是一种较为安全的补硒方式，植物通过吸收和转化将无机硒转为人体能够吸收的安全有效的有机硒，从而满足人体日常膳食需求。有研究表明，富硒土壤地区生长的植物未达到富硒标准可能是土壤本底重金属含量过高拮抗硒的吸收、土壤中硒活化率较低、不同物种对硒的吸收能力差异等因素造成的[22-24]。蔬菜是人类日常膳食最常见的食物，其中十字花科类的蔬菜具有较强的富硒能力，如芥菜、小白菜、萝卜等。萝卜（Raphanus sativus L.）属一、二年生蔬菜作物，南北方皆可栽培，为重要的经济作物，叶果皆可食用。以蔬菜作为人类补硒来源，研究其对硒的吸收转化和抗氧化能力，具有非常大的科学意义。

基于植物在天然富硒地区对硒的吸收效率较低的现象，本研究通过叶面喷施硒来干预富硒地区植物对硒吸收及利用效率，揭示叶面施硒对萝卜根际根围土壤中硒的动态分布的影响以及硒对萝卜生长、硒吸收与转化及抗氧化能力的影响。本试验通过对萝卜叶面喷施不同浓度梯度的亚硒酸钠的方式，探究外源施硒对萝卜生长、硒吸收转化和抗氧化能力的影响，从而确定最佳叶面施硒浓度，为富硒萝卜生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为盆栽萝卜（Raphanus sativus L.），品种为华灵高科笋都四季满身红。盆栽土壤采自湖南省张家界市永定区富硒地区[25]，土壤本底全硒含量为1.67 mg/kg。

1.2 试验设计

盆栽试验于2017年10月至2018年1月在张家界市永定区林产化工工程湖南省重点实验室进行。试验共设6个处理，分别为0、0.5、2.5、10.0、20.0、40.0 mg/L，每个处理10个重复。盆栽试验采用上口内径为29 cm，下口内径为19 cm，高为23 cm的不透光圆柱形塑料花盆，每盆装土10 kg，定苗为4株。分别在萝卜（叶旺盛生长期、块根膨大期、成熟期）叶面正反共喷3次亚硒酸钠溶液，间隔时间为10 d，每次每盆喷施 10 mL，以喷纯水为对照组，选阴天或晴天16：00后施硒。2018年1月18日萝卜成熟，共培养90 d，每盆选择2株代表性植株，整株收获。用蒸馏水清洗干净，拍照记录，以叶子和果实来检测萝卜总硒含量、硒形态和抗氧化能力。

1.3 测定方法

1.3.1 萝卜总硒含量测定 参照国家标准（GB 5009.93—2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》）将采集到的萝卜叶子和果实先用自来水充分洗净后，再用超纯水反复冲洗干净，放入70 ℃烘箱中烘干，粉碎后过60目筛制成样品，精确称取0.200 0 g，加6 mL硝酸冷浸过夜，加2 mL H2O2，电热板上消解至澄清，再加3 mL 6 mol/L盐酸消解0.5 h。冷却后从电热板取下，定容至25 mL容量瓶，利用SA-10氢化物发生-原子荧光法测定[26]。

1.3.2 土壤总硒含量测定 参照（NY/T 1104—2006《土壤中全硒的测定》）将萝卜盆栽所用土壤放入70 ℃烘箱中烘干，粉碎后过60 目筛制成样品，精确称取0.200 0 g，加5 mL硝酸冷浸过夜，再加 5 mL 高氯酸，电热板上消解至澄清，再加3 mL 6 mol/L盐酸消解0.5 h。冷却后从电热板取下，定容至25 mL容量瓶，利用SA-10氢化物发生-原子荧光法测定。

1.3.3 硒形态测定 参照文献[27-28]将冷冻干燥后的萝卜鲜样粉碎，过60目筛，取0.500 0 g于离心管中，称取8 mg链霉蛋白酶E溶于10 mL水，加入到离心管中，混匀，37 ℃恒温水浴振荡提取24 h。上述提取完成，12 000 r/min离心 10 min，取上清液，过0.22 μm有机滤膜，再利用SA-10液相色谱-原子荧光形态分析仪（HPLC-HG-AFS）进行测定。

1.3.4 抗氧化能力测定 称取新鲜萝卜叶3.000 0 g，在冰冷的生理盐水中漂洗干净，用滤纸擦干，在冰水浴中剪碎萝卜叶子，放入研钵，配置30 mL 0.86%冷生理盐水作为匀浆介质，倒1/3于研钵使萝卜叶子充分研碎，制成匀浆，再用剩余2/3冷生理盐水冲洗残留在研钵上的萝卜匀浆，得到10%萝卜叶子匀浆，在3 000 r/min离心15 min取上清液测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，分别在412、420、550 nm波长条件下测定其吸光度，显色过程和计算方法均参照南京建成试剂盒说明方法来进行，以上3种抗氧化酶活性测定均重复3次，结果取平均值。

1.4 数据分析

采用软件Excel 2010、Origin 8.5软件进行数据处理分析，SAS 9.2 Duncans新负极差法进行多重比较。

转移系数（TF）是元素转移到植物体内及在植株不同部位间转移的效率。本研究以蘿卜果实和叶片硒含量的比值来表示转移系数的大小。萝卜硒转移系数=萝卜果实硒含量/萝卜叶片硒含量。

2 结果与分析

2.1 叶面喷施亚硒酸钠对萝卜生长发育的影响

叶面喷施亚硒酸钠对萝卜生长的影响结果如图1所示，结果表明，0（对照组）、0.5、2.5 mg/L硒处理组的萝卜叶色葱绿，果实壮硕，长势较好。而10.0、20.0、40.0 mg/L硒处理组萝卜叶片微卷，且40.0 mg/L处理组果实矮小，切开果肉发紫，出现一定的病变症状。

叶面喷施亚硒酸钠对萝卜生物量的影响如图2所示，结果表明，与对照组相比，0.5、2.5 mg/L硒处理组果实生物量有一定的提高，分别增加了7.49%、7.61%;40.0 mg/L硒处理组果实的生物量降低了38.91%，但与对照差异不显著。随着叶面喷施亚硒酸钠的浓度增加，萝卜叶生物量无显著变化，但萝卜果实生物量呈降低趋势，且40.0 mg/L处理组萝卜果实生物量与0.5、2.5 mg/L硒处理组相比显著降低。

2.2 叶面喷施亚硒酸钠对萝卜总硒含量的影响

随着叶面喷施硒浓度增加，萝卜叶和果实中硒含量均呈明显的增加趋势（图3）。萝卜叶对硒的积累明显高于果实，40.0 mg/L处理组叶子和果实中硒含量达到6.37、0.63 mg/kg，是对照组的萝卜叶子硒含量的33.5倍和果实硒含量的7倍。不同施硒浓度处理间硒含量表现出明显差异，其中0.5 mg/L处理组与对照组相比叶和果实中硒含量略有提升，但差异不显著，2.5、10.0、20.0、40.0 mg/L处理组处理后萝卜叶和果实硒含量显著高于对照组分（P<0.05），其中40.0 mg/L处理组效果最为明显，这说明随着外源施硒浓度的增加，萝卜叶和果实对硒的富集能力增强，叶面施硒能够有效提高萝卜叶、果实中硒含量，萝卜对硒具有较好的吸收和富集能力。对照组和硒处理组中叶硒含量均高于果实，说明叶面施硒后萝卜对硒的吸收转化主要存在于叶中，只有部分转运至萝卜果实。

如表1所示，随着叶面喷施硒浓度的增加，萝卜硒转移系数呈下降趋势，表明较低浓度的硒能够高效地被植物吸收转运，但当施硒浓度过高时植物对硒的转运率会降低。

2.3 叶面喷施亚硒酸钠对萝卜盆栽土壤中硒转运的影响

如图4所示，叶面喷施亚硒酸钠各处理中，除10.0 mg/L处理以外其他各处理间萝卜生长根际土壤硒含量均无显著差异。在10.0 mg/L硒处理条件下，根际土壤硒含量显著降低，说明该浓度促进根部生长，使得根部从土壤中硒吸收的能力增强。0.5、2.5、10.0 mg/L硒处理条件下根围土壤硒含量显著低于对照组。在2.5 mg/L硒处理条件下，根际土壤硒含量显著高于根围土壤硒含量（P=0.0231<0.05）而0.5、10.0、20.0、40.0 mg/L 硒处理组根际土壤硒含量与根围土壤硒含量没有显著差异，这说明2.5 mg/L硒处理萝卜植株生长旺盛、根系发达，从根围吸收硒的能力较强。但当外源硒浓度过高时，抑制了萝卜对根围土壤中硒含量的吸收和转运。

2.4 叶面喷施亚硒酸钠对萝卜硒形态的影响

萝卜叶中硒主要以SeMet、SeCys2、Se （Ⅳ）3种形式存在（图5、表2、表3），其中SeMet含量达1.51 mg/kg，SeCys2含量0.47 mg/kg，Se （Ⅳ）含量0.08 mg/kg;萝卜果实中硒主要以SeMet、SeCys2等2种形式存在，其中SeCys2含量 0.29 mg/kg，SeMet含量达0.10 mg/kg， 且没有四价硒存在，说明萝卜从叶中吸收无机硒在体内进行转化变为有机硒。

2.5 叶面喷施亚硒酸钠对萝卜抗氧化能力的影响

6个处理组的萝卜叶片中GSH-Px、POD、SOD的活性差异见图6，可以看出与对照组相比，萝卜叶中GSH-Px活性随着施硒浓度升高有着显著变化，0.5、2.5 mg/L硒处理先增大，10.0、20.0、40.0 mg/L硒处理又有明显的下降趋势。可见适宜浓度的硒能够促进GSH-Px合成，从而提高酶的活性，但是过量的硒可能会破坏植物体内的代谢平衡，本研究中，与对照组相比，2.5 mg/L硒处理组叶片中GSH-Px活性增加了106.26%（P<0.05），40.0 mg/L处理组叶中 GSH-Px 活性降低了5.86%。这可能是高浓度的硒影响了 GSH-Px 合成的诱导信号，从而破坏了植物体内环境平衡，导致GSH-Px活性降低。

与对照组相比，POD活性在0.5、2.5 mg/L硒处理条件下显著增加，分别增加了10.46%、14.87%（P<0.05）;在100、20.0、40.0 mg/L硒处理组有一定的降低趋势。与对照组相比，总SOD活性在0.5、2.5、10.0、20.0 mg/L硒处理下有一定的上升趋势，无显著性差异，但是在40.0 mg/L硒处理组却显著降低了40.49%（P<0.05）。本研究中POD、SOD活性没有随着外源施硒浓度的增加而出现显著性变化趋势，可能是由于POD的辅酶因子是铁，SOD的辅酶因子是铁、锰、铜、锌，外源硒通过影响辅酶因子的吸收和在分布，从而调节抗氧化酶活性。因此对POD、SOD 2种酶活性的影响不是十分显著。

3 讨论与结论

硒不是植物必需微量元素，但一定浓度的硒能够影响植物的生长发育、果实品质和产量[29-30]。本试验中，叶面喷施2.5 mg/L的亚硒酸钠对萝卜果实有增产作用，随着喷施浓度的升高，产量下降，果实颜色发紫，有明显的病变现象。可见萝卜的产量受施硒浓度的影响，适量的施硒浓度能够促进萝卜生长，提高产量，但是过量的硒则会抑制萝卜生长，还可能出现病变。该结果与硒对小麦和油菜[31]、苜蓿[32]生物量影响的研究结果一致。

萝卜叶和果实中硒吸收富集量随着外源施硒浓度增加而增加，并未出现对硒吸收同化的抑制作用，但萝卜对硒的转移系数是逐渐降低的，这与硒在小麦[33]、紫甘薯[34]中富集規律一致，说明高等植物对硒的吸收富集机制是相当复杂的，值得进一步研究。萝卜不同部位吸收硒的能力有差异，本研究发现硒主要累积在萝卜叶中，果实中转移量较少。这与在甜菜、大麦、番茄上的研究结果[35-36]一致，植物的可食用部位富硒能力低于非食用部位。研究发现，十字花科芜菁甘蓝硒吸收含量和土壤本底中硒含量没有显著的相关性[37]。本试验所用盆栽土壤本底硒含量为1.67 mg/kg，但对照组萝卜叶和果实中硒含量较低，说明在自然土壤条件下萝卜对硒的吸收和转运能力较低，可能是由于土壤中有效态硒含量较低等因素导致[23]。并且不同种属的植物在同环境下硒富集能力也是有差异的[24]。通过叶面施硒能够显著提高萝卜对硒的吸收富集能力，因此不同植物对硒的富集能力是由外源施硒方式、施硒浓度、生长环境有效硒含量和植物种类等多重因素共同决定的。

大多数植物性硒源中有机硒主要以硒代蛋氨酸形式存在的[38]。叶用莴苣以四价硒作为硒源，发现约有1/3转化为硒代蛋氨酸[39]。本试验中萝卜叶中有机硒主要以硒代蛋氨酸为主，含量为1.51 mg/kg，而萝卜果实中有机硒为硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，其中硒代胱氨酸的含量达 0.29 mg/kg，未检出四价硒，说明叶面喷施亚硒酸钠经萝卜转化吸收变为有机硒存在于萝卜果实中。

硒能够通过影响抗氧化酶活性从而增强植物的抗氧化能力。硒作为植物生长有益的元素之一，参与合成谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），通过调节植物内环境离子平衡，来提高过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性[40]。三叶草施加低浓度（1～5 μmol/L）硒能够提高SOD、POD活性，高浓度（10～30 μmol/L）条件则会出现降低[41]。本研究中在一定硒浓度范围内，能够不同程度提高3种抗氧化酶（GSH-Px、POD、SOD）的活性。随着施硒浓度的增加，GSH-Px、POD、SOD活性呈现明显的先增大后降低的趋势，40 mg/L硒处理组时3种酶活明显降低，可能是由于当硒浓度过高会对植物产生毒害作用，导致抗氧化酶活性出现明显降低。因此，适宜浓度的外源施硒能够提高GSH-Px、POD、SOD酶活性，从而增强植物的抗氧化能力。

外源叶面施硒能够促进生长在土壤有效硒含量较低的环境中的萝卜吸收富集硒。综合本研究结果发现，叶面喷施25 mg/L硒处理有利于促进萝卜生长，提高萝卜硒含量，增强抗氧化能力。40.0 mg/L硒处理会抑制萝卜生长，降低其抗氧化能力，出现病变症状，导致植物产量、品质降低。植物虽然处在富硒环境土壤中但其对土壤中硒的吸收和转运受植物种类和生长环境等因素的影响，导致植物对硒的吸收转化差异化，因此结合外源叶面施硒能够较好地达到植物富硒要求。

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