宽谱噬菌体NTHP01的生理特征及噬菌作用

吕孙建　袁雪梅　刘莉　卢淑娟　杭小英　施伟达

摘要：针对1株从中华鳖养殖塘中分离得到的宽谱噬菌体NTHP01（保藏号：CGMCC No. 9623），对其感染复数、潜伏期和裂解期、热稳定性、pH稳定性等理化特性展开研究，探讨了氯化镁促噬菌体感染的最佳浓度，并考察了该噬菌体的噬菌谱。结果显示，噬菌体NTHP01的最佳感染复数为0.01，潜伏期和裂解期分别为150、60 min，最适温度为 30 ℃，最适pH值为7，氯化镁终浓度为4 mmol/L时对噬菌体的感染促进作用最佳。此外，结果显示噬菌体NTHP01宿主范围宽，能够有效抑制来自不同水产养殖品种的细菌，包括嗜水气单胞菌、脑膜脓毒性黄杆菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血性弧菌、维氏气单胞菌、腐败希瓦菌、温和气单胞菌等。研究结果为噬菌体NTHP01的规模化制备及今后在水产养殖细菌性病害防治中的应用奠定了良好基础。

关键词：噬菌体;生理特征;抑菌作用;宿主范围

中图分类号： S947.1+2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）03-0132-03

细菌性病害是水产养殖的常见病害，长期以来，抗生素在水产养殖病害防治中发挥着重要作用，但由此引发的耐药菌增加、药物残留、水体环境生态问题等不良后果[1-2]，已引起社会的广泛关注，无抗生素养殖的技术支撑需求凸显。噬菌体作为天然的生物抗菌制剂，具有见效快、无毒害、无污染等特点，可能替代抗生素在水产养殖细菌性病害防治方面发挥重要作用。噬菌体是一种以细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物作为宿主的病毒，因此在许多细菌聚集的区域都能找到噬菌体，它能够特异性地杀死宿主菌，达到预防和治疗的目的。噬菌体作为细菌性病害控制的方法之一，相关研究已在医学、畜牧及水产养殖等领域被关注和重视。2005年，Bruttin和Brussow[3]临床试验验证了噬菌体在使用、治疗过程中的安全性。目前，已有的文献报道发现噬菌体对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[4]、沙门氏菌（Salmonella）[5]、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[6]等细菌均有较好的抑制效果。

本实验室从中华鳖养殖塘中分离纯化获得1株噬菌体NTHP01（保藏号：CGMCC No. 9623），前期研究发现对中华鳖一些细菌性病害有较好的防治作用。为进一步拓展该噬菌体在水产养殖中的应用，本研究对该噬菌体最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI）、潜伏期、暴发期、热稳定性、pH稳定性等理化特性进行测定，同时还探讨了阳离子化合物氯化镁促进噬菌体感染的最佳浓度，以及噬菌体对水产养殖常见致病菌的抑菌效果，为后续规模化生产并应用于水产养殖病害防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 试验所用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、脑膜脓毒性金黄杆菌（Elizabethkingia meningoseptic）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）分离自中华鳖养殖池，副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）分离自南美白对虾养殖池，腐败希瓦菌（Shewanella putrefaciens）分离自红螯螯虾养殖池，温和气单胞菌（Aeromonas sobria）分离自鲈鱼养殖池，试验用细菌均保存于浙江省淡水水产研究所。

1.1.2 培养基 噬菌体培养按试验内容不同分别采用TSB液体培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）、固体培养基（琼脂浓度为2%）和半固体培养基（琼脂浓度为1.2%）进行培养。

1.2 方法

1.2.1 最适感染复数（MOI）测定 感染复数（multiplicity of infection，MOI）是指感染时噬菌体与指示菌数量的比值。将已知浓度噬菌体稀释至1×108 PFU/mL，再进行10倍梯度分别稀释至1×107、1×106、1×105 PFU/mL;同时将宿主菌（维氏气单胞菌）摇至1×108 CFU/mL，同样稀释至1×107、1×106、1×105 CFU/mL。按表1进行7个不同MOI（1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001）各取100 μL在 1.5 mL Eppendorf管中混合，再加入800 μL新鮮TSB培养液，28 ℃培养3.5 h。取出后分别测定各管中噬菌体效价，3.5 h 滴度最高所对应的MOI即为最适感染复数。

1.2.2 一步生长曲线测定 将噬菌体按最适MOI与宿主菌（维氏气单胞菌）按1 ∶ 1混合，置于28 ℃培养箱温育吸附 15 min 后，12 000 r/min离心1 min，去除上清。获得的沉淀用20 mL 28 ℃预热的TSB液体培养基重悬，于28 ℃ 120 r/min 振荡培养。每隔5 min取样1次，25 min之后每隔15 min取样，连续取样3.5 h，在4.5 h时最后取1次。每次取500 μL，使用0.45 μm滤膜过滤后获得的滤液采用双层琼脂培养法测定噬菌体效价。以培养时间为横坐标、噬菌体滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线。

1.2.3 热稳定性测定 将噬菌体原液稀释至5×107 PFU/mL 并分装于2 mL离心管中，分别放置于30、40、50、60 ℃的恒温水浴锅中，每隔20 min测定各管噬菌体的滴度，至100 min停止检测，测定噬菌体的耐受温度和耐受时间。

1.2.4 pH值稳定性 以TSB培养液为介质，调节pH值为4、5、6、7、8、9、10、11。取滴度为5×108 PFU/mL的噬菌体原液100 μL，加入到900 μL不同pH值的TSB培养液中，28 ℃水浴2 h后测定各管噬菌体的滴度，并计算噬菌体的最适pH值范围。

1.2.5 氯化镁促进噬菌体感染的最佳浓度 在各10 mL培养基中加入100 μL宿主菌（维氏气单胞菌）1×108 CFU/mL，37 ℃摇床培养3 h。然后加入1×108 PFU/mL的噬菌体原液100 μL，及不同终浓度氯化镁（0、2、4、8、16、32 mmol/L），作用30 min后置于37 ℃摇床培养4 h，取出后分别测定各管中噬菌体效价。

1.2.6 噬菌体对水产养殖病原菌的噬菌作用 采用滴注法观察噬菌体的噬菌效果。滴注法是首先配制2% TSB琼脂培养基融化后铺平培养皿底层，凝固后为固体培养基。用涂布法将宿主菌涂满这个平板，待平板表面风干3～5 min后，再在平板上滴加5 μL噬菌体液，28 ℃培养过夜，观察噬菌效果。

2 结果与分析

2.1 最适感染复数（MOI）

取不同感染复数的噬菌体和维氏气单胞菌，MOI分别为1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001，培养3.5 h后测得相应的噬菌体滴度。结果显示，该噬菌体感染复数为1、10、100、1 000、0.001时，噬菌体滴度较低，在0.1、0.01时，噬菌体滴度较高（图1），表明NTHP01对于维氏气单胞菌的最适感染复数为0.01。

2.2 一步生长曲线

按最适感染复数0.01将噬菌体与维氏气单胞菌混合，通过离心、沉淀、振荡培养等操作后，取样4.5 h，采用双层琼脂培养法测定滤液中噬菌体效价，获得的一步生长曲线（图2）。结果显示，该噬菌体在前150 min未有明显增长，而在 150 min 开始至210 min爆发性增加，之后进入了平稳期。结果表明，噬菌体NTPH01对于维氏气单胞菌的潜伏期和裂解期分别为150、60 min。

2.3 热稳定性

对不同温度下作用时间与噬菌体滴度的常用对数作图。结果（图3）显示，该噬菌体在30～40 ℃区间内，噬菌体滴度均在106 PFU/mL以上，相比较原始滴度107 PFU/mL并未明显降低，整体上存活率高。温度达到50 ℃及以上时，该噬菌体在20 min内快速失活，20 min时滴度只有105 PFU/mL，当时间在100 min时，50 ℃噬菌体滴度仅为104 PFU/mL，大部分死亡，表现出该噬菌体对50 ℃以上的温度高度敏感，活性较低。

2.4 pH稳定性

噬菌体NTHP01在pH值为7～10的条件下，滴度保持在107 PFU/mL以上，与初始滴度保持一致，即噬菌体在此pH值区间保持较高的生物活性（图4），且在pH值为7时活性最高。pH值小于7或大于10时，随着酸性或碱性增强，噬菌体活性逐渐下降，但总体还保持着较好的活性。

2.5 氯化镁促进对噬菌体感染的最佳浓度

不同浓度氯化镁对噬菌体感染影响的结果显示，添加氯化镁的噬菌体滴度明显高于未添加，且在氯化镁终浓度为 4 mmol/L 时，促进噬菌体对宿主菌的感染作用最佳（图5）。在氯化镁终浓度低于4 mmol/L，随着氯化镁浓度的增加而增高;当加入的氯化镁终浓度大于4 mmol/L时，随着氯化镁浓度的增加，促进作用减弱。

2.6 噬菌体对水产养殖病原菌的噬菌作用

针对水产养殖中常见的致病菌进行噬菌体噬菌试验，结果表明，噬菌体NTHP01对大多数常见的病原菌均具有较好的裂解作用（表2）。由图6-A和图6-B可知，温和气单胞菌和腐败希瓦菌滴加噬菌体后，可见明显的噬菌斑，说明该噬菌体对这些细菌均有较好的裂解效果。

3 讨论

本研究测定了噬菌体NTHP01的最适感染复数为0.01，潜伏期和暴发期分别为150、60 min，为后续噬菌体的大量制备提供了理论数据基础。目前，水产养殖水体的一般温度在20～40 ℃ 之间，呈弱碱性。对该噬菌体热稳定性及pH值稳定性进行了试验，发现该噬菌体在30～40 ℃之间内能够保持较好的稳定性及活性，并在酸碱环境中表现出较好的适应性。

该研究表明，噬菌体NTHP01可以很好地适应水产养殖环境，在水产养殖中应用具有极大的可能性。

噬菌体作为细菌的天敌，具有见效快、无毒害、无污染的特点，受到人们的高度关注[7]。1999年，Nakai等通过黄尾鱼的对照实验研究发现口服或者注射PLgY-16噬菌体可以有效提高黄尾鱼的存活率[8]。2003年，Park等在噬菌体治疗试验中，分别给香鱼饲喂含变形假单胞菌饲料（107 CFU/尾），然后喂分别含有PPpW-3、PPpW-4、PPpW-3/W-4噬菌体的饲料（107 CFU/尾），发现死亡率分别为53.3%、40.0%、20.0%，而对照组死亡率为93.3%，表明PPpW-3/W-4噬菌体能够有效地降低由变形假单胞菌引起的鱼类病变、死亡[9]。2007年，Karunasagar等从牡蛎组织和虾孵化场分离出4个噬菌体，对其中2个进一步研究发现可以有效降低哈维氏菌群。在孵化场试验中，2×106 PFU/mL的噬菌体处理可以使虾幼虫存活率超过85%[10]。2013年，Jun等分离出pAh1-C和pAh6-C这2株噬菌体，发现对鱼类致病性嗜水气单胞菌均显示出有效的溶菌活性，并且测得潛伏期约 30 min（pAh1-C）和20 min（pAh6-C），裂解数量为60 PFU/细胞（pAh1-C）和10 PFU/细胞（pAh6-C）[11]。本研究分离得到的噬菌体NTHP01对多种病原菌具有良好的裂解作用，通过双层平板法和滴注法发现该噬菌体能够有效抑制水产养殖中的大多数致病菌，如副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、变形假单胞菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌等，并形成明显的噬菌圈。噬菌体NTHP01的宽谱性显示，它在水产养殖中具有较为广泛的应用前景，为水产健康生态养殖、保障水产品安全及抗生素减量使用提供了新的技术手段。

综上所述，噬菌体NTHP01噬菌谱宽，对水产养殖中的大多数致病菌具有较好的抑制作用，为噬菌体作为替代抗生素在水产病防控中的应用提供了一定的理论依据。通过分析掌握噬菌体的理化特征，为后续规模化制备提供了理论依据，为该噬菌体在水产养殖中的推广应用奠定了基础。

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