蛋白质修饰粪肠球菌的体内致突变作用

丁丽军， 陈林中日， 庞艳华， 雷伟伟， 张雨梅

(1.江苏农牧科技职业技术学院，江苏泰州 225300； 2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009

粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)又称粪链球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一[1]，在动物肠道内可形成生物薄膜附着于动物肠道黏膜上，并且生长、发育和繁殖。我国《饲料添加剂品种目录(2013)》将粪肠球菌规定为可以添加到饲料中的菌种。粪肠球菌能够将饲料中的纤维变软，提高饲料的转化率。研究发现在玉米秸秆青贮饲料中添加粪肠球菌和纤维素酶，能使青贮饲料的色泽、气味和质地等发生明显的改善，干物质消化率提高8%，氨态氮与总氮质量比降低33%，丁酸质量分数降低82%，明显提高了饲料品质[2]。饲粮中添加粪肠球菌具有提高动物生产性能、改善营养物质代谢和提高免疫功能等作用[3-5]。粪肠球菌能够产生多种抗菌物质，这些抗菌物质对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等致病菌具有良好的抑制作用[6-8]。粪肠球菌作为益生菌在畜禽上的研究和应用也越来越多。本研究拟通过小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验，探讨蛋白质修饰粪肠球菌在体内的致突变作用，为该粪肠球菌的应用安全性评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

受试物蛋白质修饰粪肠球菌粉，由江苏省某生物技术公司研制，5×109CFU/g，批号20141206。临用前配成所需浓度的水溶液。

ICR小鼠，雌雄各半，体质量(22±2) g，共70只；ICR雄性小鼠，体质量(28±2) g，共50只，购自扬州大学比较医学中心，动物生产许可证号：SCXK(苏)2012-0004，使用许可证号：SYXK(苏)2012-0029。饲喂经60Co照射饲料，自然光照，室温 (24±2) ℃，湿度(60±20)%，自由采食和饮水，饮水为符合城市饮用水标准的自来水。

pH值6.47磷酸缓冲液配制：称取Na2HPO4·12H2O 23.88 g，溶于1 000 mL蒸馏水，为甲液；称取KH2PO49.08 g溶于1 000 mL蒸馏水，为乙液。取甲液30 mL和乙液70 mL混合即为pH值6.47磷酸缓冲液。

姬姆萨(Giemsa)染液：取1.5 g姬姆萨原粉，加50 mL甘油，置于60 ℃温箱，约3 h后溶解。取出后加入50 mL甲醇，即为母液。使用前将母液与pH值6.47磷酸缓冲液按1 ∶10的比例混合成工作液。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验 预试验中，小鼠剂量高达10 g/kg(按体质量计，下同)时均无死亡，说明受试物毒性较小，根据急性毒性操作规程，进行最大给药量试验。小鼠20只，雌、雄各半，24 h内灌胃2次，给予总剂量为10 g/kg。小鼠灌胃前，禁食12 h，自由饮水。灌胃后，继续停食1 h，观察动物的反应情况7～14 d，并记录中毒症状或死亡数。

1.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验

1.2.2.1 染毒 受试物3个剂量组分别为5、2、1 g/kg。另设阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组，阴性对照组经口给予生理盐水，阳性对照组给予80 mg/kg环磷酰胺一次性腹腔注射。受试物采用不同浓度等体积灌胃，0.2 mL/10 g体质量。染毒2次，时间间隔24 h。每组10只小鼠，雌雄各半，在第二次灌胃后6 h，脱颈椎处死小鼠。

1.2.2.2 制片染色 取小鼠两侧股骨，剪去股骨两端。用小牛血清0.05 mL冲洗骨髓腔，于载玻片上推匀，晾干。涂片经甲醇固定5～10 min，晾干后，姬姆萨染液染色20 min。蒸馏水冲洗，干燥，镜检。

1.2.2.3 镜检及微核细胞计数 油镜下可见嗜多染红细胞(PCE)呈灰蓝色，成熟的正染红细胞(NCE)呈粉红色。计数每只小鼠1 000个PCE中具有微核的细胞数，计算微核率。微核率=有微核的PCE总数/检查的PCE总数×1000‰，微核率以‰表示。另外计数200个红细胞中的PCE和NCE数，求出PCE/NCE的值。

1.2.2.4 结果判定 若微核率统计结果差异显著(P<0.05)并有剂量反应关系时判为阳性，反之则为阴性。PCE/NCE的比值应在0.6～1.2的范围内。若比值小于0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；若比值小于0.05，则表示受试物剂量过大，试验结果不可靠。

1.2.3 小鼠精子畸形试验

1.2.3.1 染毒剂量途经 ICR雄性小鼠，每组10只，每天染毒1次，连续5 d。受试物水溶液灌胃给予，灌胃体积为 0.2 mL/10 g体质量，剂量分别为5、2、1 g/kg；另以40 mg/kg环磷酰胺腹腔注射为阳性对照，生理盐水灌胃为阴性对照。

1.2.3.2 观察 于第一次给予受试物后35 d脱颈椎处死小鼠，取两侧附睾制成精子悬液，涂片、晾干后，2%伊红染色、镜检。每只小鼠观察1 000个精子，计数畸形精子数，计算精子畸形率并分析畸形类别。

1.2.3.3 结果判定 出现可重复的剂量-反应关系时，可判定试验结果为阳性。即至少有2个相邻剂量组的精子畸形率比阴性对照组极显著增高(P<0.01)；或达到阴性对照组的2倍及以上，并且试验结果可重复，则可认为试验结果阳性；反之则为阴性。

1.3 数据统计

数据统计采用SPSS 12.0，显著性比较采用χ2分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠急性毒性试验

试验中当剂量高达10 g/kg时小鼠均无死亡。因此，受试物小鼠经口LD50>10 g/kg。根据WHO关于外源化学物急性毒性分级标准，当LD50>5 000 mg/kg时为实际无毒级别，故受试物蛋白质修饰粪肠球菌属于实际无毒物质。

2.2 小鼠骨髓细胞微核试验

微核率和PCE/NCE统计结果见表1。各试验组 PCE/NCE 比值在正常范围内，说明本试验方法可行。阳性对照组与阴性对照组比较差异极显著(P<0.01)。受试物各试验组微核率与阳性对照组比较差异极显著(P<0.01)；与阴性对照组比较差异不显著(P>0.05)，且各试验组微核率之间无剂量-反应关系。根据微核试验判定标准，受试小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性。

表1 蛋白质修饰粪肠球菌微核率和PCE/NCE统计

注：*表示与阴性对照组比较差异极显著(P<0.01)；#表示与阳性对照组比较差异极显著(P<0.01)。表2同。

2.3 小鼠精子畸形试验

受试物小鼠精子畸形试验结果见表2和表3。阳性对照组精子畸形率显著高于阴性对照组(P<0.01)。受试物3个剂量组的精子畸形率与阴性对照组比较，无显著性差异(P﹥0.05)。受试物精子畸形类别与阳性对照组相似，畸形主要以无钩、香蕉形、无定形及胖头4种为主，占90%以上，其他类别所占例较小。受试物小鼠精子畸形试验结果为阴性，表明蛋白球菌对小鼠的生殖细胞无明显的致突变性。

表2 蛋白质修饰粪肠球菌小鼠精子畸形试验率

表3 蛋白质修饰粪肠球菌小鼠精子畸形类别统计

3 结论与讨论

受试物小鼠骨髓细胞微核试验阴性、小鼠精子畸形试验阴性，说明受试物在体内对体细胞和生殖细胞无明显的致突变作用。

本课题组进行的受试物对鼠伤寒沙门氏菌突变试验的结果也为阴性(此部分内容另文发表)。因此，受试物在体外Ames试验、体内小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验中均为阴性结果，说明蛋白质修饰粪肠球菌无致突变作用。

由于受试物LD50大于10 g/kg，小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验中的剂量5、2、1 g/kg，是按照1/2 LD50、1/5 LD50和1/10 LD50设置的。虽然试验剂量相对较大，但小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验的结果仍然为阴性。