利用纳米金法评价百合总黄酮的抗氧化性

杜 娟， 罗 立， 黄 洁， 罗秋水

(江西农业大学食品科学与工程学院/南昌市农产品加工及质量控制重点实验室，江西南昌 330045

金纳米粒子因其独特的物理化学性能而在近年来得到了广泛关注，在各领域都有广泛的应用。合成金纳米粒子的方法有许多，金种子法是其中的一种。该方法以硼氢化钠为还原剂还原氯金酸制备金种子，而后加入适当的保护剂阻止其聚集形成大颗粒，形成金纳米粒子[1]。近年来，众多报道表明植物提取液可作为保护剂用于金纳米粒子的合成，其中起主要作用的为黄酮类化合物[2]。

黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物[3]，广泛存在于高等植物及羊齿类植物的根、茎、叶、花、果实等中，不仅数量繁多，而且结构类型复杂多样。黄酮类化合物具有多种生理功能，主要有抗氧化功能、抗心率失常功能、抗肿瘤抗癌功能、镇咳祛痰平喘功能、抗炎功能、抗菌抗病毒功能、类激素样功能及免疫调节功能等[4-5]。其中抗氧化功能是目前的研究重点，目前检测抗氧化性的方法多为1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法等。

香水百合花色艳丽，芳香宜人，是单子叶植物亚纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物，常用于观赏。目前，对其研究多集中于组织培养和栽培栽种，对其化学成分的研究较少。前期试验表明，香水百合中总黄酮化合物的含量较高，且具有一定的抗氧化性[6]。笔者以百合总黄酮提取物为保护剂还原金种子，建立了利用纳米金法评价百合黄酮抗氧化性的方法。以没食子酸为对照，比较了香水百合、食用百合、药用百合3种百合总黄酮化合物抗氧化性的强弱，并与传统的DPPH法得到的结果相对比。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂与材料 芸香苷、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、没食子酸、氯金酸、硼氢化钠、碳酸钾、浓盐酸、浓硝酸皆为分析纯，DPPH为生化试剂，香水百合、药用百合、食用百合皆购自当地商店。

1.1.2 仪器 XY-200型高速多功能型粉碎机；UV-9100紫外可见分光光度计；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱；BS224S电子天平；HH-4数显恒温水浴锅；SHZ-D(Ⅲ)予华牌循环水真空泵；移液枪；控温磁力搅拌器；超声波清洗器。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮的提取及含量测定 (1)总黄酮提取：精确称取0.5 g干燥后的香水百合、药用百合、食用百合粉末，以70%乙醇水溶液为提取剂，料液比为1 g ∶30 mL，在50 ℃下水浴提取1.5 h，过滤，提取液以70%乙醇定容至100 mL。(2)总黄酮含量测定：精确称取205 mg干燥至恒质量的芸香苷粉末，用70%甲醇溶解得芸香苷储备液，使用时用70%甲醇稀释至0.205 mg/mL，为芸香苷稀释液。移取芸香苷稀释液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分别放置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液至总体积为6 mL，再分别加入5%亚硝酸钠各2.00 mL，振荡均匀，放置6 min，然后加入10%氯化铝1.00 mL，振荡均匀，放置6 min，最后加4%氢氧化钠20.00 mL，摇匀，用水定容至刻度线，放置15 min，在 510 nm 波长处测定吸光度。以芸香苷浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。从100 mL各提取液中移取 1.5 mL 总黄酮提取液至50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液至6 mL，按测定标准曲线的方法进行测定，求得各提取液中黄酮的含量。

1.2.2 纳米金法评价百合总黄酮抗氧化性 (1)金种子的制备。取100 mL经4 ℃冷藏的超纯水，加入1.5 mL 1%(质量浓度)HAuCl4溶液，在持续搅拌状态下加入0.5 mL 0.2 mol/L K2CO3溶液，再加入4.5 mL 0.5 mg/mL NaBH4溶液，持续搅拌 5 min，即得酒红色金种子溶液，4 ℃保存。

(2)K2CO3-HAuCl4溶液的制备。称取50 mg K2CO3固体，加入100 mL超纯水，持续搅拌10 min，再向其中加入 1.5 mL 1%(质量浓度) HAuCl4溶液，继续搅拌30 min，溶液颜色由淡黄逐渐变成无色透明，即为制备成功，4 ℃保存。

(3)以没食子酸(GA)为保护剂的纳米金颗粒的生长。取 6 mL K2CO3-HAuCl4溶液于50 mL烧杯中，置于磁力搅拌器上匀速搅拌，加入100 μL金种子溶液，而后迅速加入600 μL超纯水，继续搅拌10 min，于521 nm处检测其吸光度，作为空白对照。重复上述步骤，将600 μL超纯水分别替换为浓度为0.2、0.1、0.06、0.02、0.008、0.004 mg/mL的GA溶液，分别测定其对应的吸光度。以GA浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)以百合总黄酮提取液为保护剂的纳米金颗粒的生长。分别取3种百合黄酮提取液各10 mL，浓缩至1 mL。取6 mL K2CO3-HAuCl4溶液于50 mL烧杯中，置于磁力搅拌器上匀速搅拌，加入100 μL金种子溶液，而后迅速加入600 μL超纯水，搅拌20 min后，检测其在521 nm处的吸光度，作为空白对照。重复上述步骤，将600 μL超纯水分别换成3种不同类型的黄酮提取液，测定相应的吸光度，并根据上一步得到的标准曲线求得各黄酮提取液对应的GA当量，每个样品平行做2份，取平均值。

1.2.3 DPPH法评价百合总黄酮抗氧化性[7]将浓度为 2.0×10-4mol/L DPPH乙醇溶液2 mL和各百合黄酮提取液2 mL在试管中混匀，25 ℃下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度。用乙醇作空白对照。以没食子酸为标准对照，DPPH自由基清除率由下式计算，每个样品平行做2份，取平均值。

(1)

式中：S表示DPPH自由基清除率(%)；Di表示2 mL DDPH溶液和2 mL样品溶液混合后在517 mm下的吸光度；Dj表示2 mL样品溶液和2 mL乙醇溶剂混合液在517 mm下的吸光度；D0表示2 mL DDPH溶液和2 mL乙醇溶剂混合液在 517 mm 下的吸光度。

2 结果与分析

2.1 3种百合中的黄酮含量

分光光度法是测定黄酮含量的常用方法。黄酮分子B环上的3，4-邻二苯酚羟基可与铝离子在碱性条件下络合，生成棕红色的金属络合物。以芸香苷为标准品作标准曲线，可得线性方程为y=0.011x-0.001 1，将各黄酮提取液样品测得的吸光度代入线性方程，可求得3种百合黄酮提取液的总黄酮平均浓度：香水百合为10.74%、药用百合为0.92%、食用百合为0.14%。结果表明，香水百合中总黄酮含量远高于药用百合和食用百合。

2.2 纳米金法评价抗氧化性

没食子酸或黄酮类化合物具有抗氧化性，加入金种子溶液中可起到保护剂的作用，阻止纳米金粒子的进一步聚集，形成具有一定颗粒大小的纳米金溶液。在本试验中将不同浓度的没食子酸溶液加入金种子溶液中，观察反应后的颜色变化，结果表明，加入没食子酸之后，溶液呈酒红色，说明生成了纳米金粒子，且随没食子酸浓度的增大，溶液的颜色逐渐加深，表明生成的纳米金粒子的颗粒也越多。扫描各溶液的紫外光谱，不同溶液的最大吸收峰位于521 nm，为金纳米粒子的特征吸收峰，且吸光度随没食子酸浓度的增大而增大。从图1可以看出，在试验所选的浓度范围内(0.004～0.20 mg/mL)，溶液的吸光度与没食子酸的浓度呈线性关系，线性方程为y=4.630 4x-0.001 1，r2=0.997。反应溶液的透射电子显微镜(TEM)结果见图2，由TEM图可见纳米金粒子的生成，生成的纳米金粒子近似于球形，粒径约为20 nm。

采用同样的方法，用3种百合的总黄酮提取液替换没食子酸，分别进行反应，并测其吸光度。分别将其吸光度代入至没食子酸的线性方程中，求得对应的X值，即为抗坏血酸当量。GA当量越大，说明该百合黄酮提取液抗氧化性越强。根据计算可求得3种百合黄酮提取液的GA当量：香水百合为63.35 μg/mL、药用百合为11.86 μg/mL、食用百合为 1.38 μg/mL。由GA当量可知，香水百合的抗氧化性最强，药用百合次之，食用百合最弱。

2.3 DPPH法评价抗氧化性

DPPH自由基是一种以氮为中心的单电子自由基，其结构简单，性质稳定。DPPH自由基乙醇溶液为紫色，最大吸收波长位于517 nm。当向其中加入自由基清除剂时，自由基清除剂能提供电子与DPPH自由基中的单电子配对，导致溶液颜色变浅，吸光度减弱。一般以DPPH自由基清除率为50%时的样品浓度(EC50)来衡量样品对DPPH自由基的清除能力，EC50值越小，样品清除DPPH自由基的能力越强。3种百合黄酮提取液和对照品没食子酸对DPPH自由基的清除情况见图3。可以看出，无论是样品还是对照品，在选定浓度区间内，对DPPH自由基的清除率与浓度成正比。通过各自的线性方程可以求得各自的EC50：没食子酸为 2.31 μg/mL， 香水百合为25.31 μg/mL、药用百合为 38.75 μg/mL、食用百合为

109.95 μg/mL。试验结果表明，在3种百合总黄酮提取液中，香水百合清除DPPH自由基的能力最强，药用百合次之，食用百合最小。该结果与纳米金法得到的结论相一致。

3 结论

本研究建立了利用纳米金颗粒生长评价3种百合总黄酮抗氧化性的方法。以没食子酸为对照，香水百合、药用百合、食用百合3种百合对应的没食子酸当量分别为63.35、11.86、1.38 μg/mL。结果表明，3种百合总黄酮抗氧化性的强弱依次为香水百合>药用百合>食用百合。在DPPH自由基的清除试验中，3种百合总黄酮提取液对DPPH均有一定的清除作用，其EC50如下：食用百合为109.95 μg/mL、药用百合为 38.75 μg/mL、香水百合为25.13 μg/mL，清除率由强到弱依次为香水百合>药用百合>食用百合，试验结果与纳米金法一致。表明与药用百合和食用百合相比，香水百合总黄酮提取物具有较强的抗氧化性，且纳米金法试验结果与DPPH法一致。可见纳米金法可作为评价黄酮抗氧化性的新方法。