猪第一极体的排出规律及其保存过程中的活性变化

徐小波， 于建宁， 王公金， 谭小东

(江苏省农业科学院畜牧研究所/农业部种养结合重点实验室，江苏南京 210014

哺乳动物卵泡中的卵母细胞是一个初级卵母细胞，在排卵前不久进行第1次减数分裂，产生1个次级卵母细胞，排出1个第一极体(PbⅠ)。与次级卵母细胞相比，PbⅠ细胞质很少，但PbⅠ作为一种特殊而又有着完整细胞功能的细胞，其生物学功能和利用价值亦受到人们重视。极体的生殖功能已经被Wakayama等证明[1-2]，小鼠PbⅠ和第二极体(PbⅡ)均能获得有生殖能力的后代；小鼠PbⅡ和雌原核已被成功冷冻并重组产生后代[3]，但尚未见其他动物极体研究的报道。

猪卵母细胞和胚胎冷冻保存相当困难，主要原因是猪卵的细胞质中含有较大的脂肪颗粒，在冻融过程中极易造成细胞破裂，而极体胞质很少，冷冻保存相对容易，通过极体重组可有效解决猪母本种质资源难以保存的难题[4]。本研究试图揭示猪卵母细胞体外培养条件下PbⅠ排出规律、形态学以及不同保存条件下存活状态等特征，以期为极体核重组猪卵母细胞等研究提供一定的理论与技术参考依据。

1 材料与方法

1.1 猪卵巢卵母细胞的采集与成熟培养

从刚屠宰的母猪采集新鲜卵巢，在无菌实验室及时用注射器抽吸3～6 mm的卵泡液，于实体镜下捡取包被着3～4层颗粒细胞的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，经TCM199预平衡2 h后，选取形态正常的COCs，进行成熟培养(含5% CO2的空气，饱和湿度，39 ℃)24～72 h，于倒置显微镜下观察卵丘细胞扩散状态。

1.2 PbⅠ的排出、形态分级和活性鉴定

取不同时间段体外成熟培养的COCs，在倒置显微镜下用显微操作针拨动卵母细胞，观察PbⅠ的排出情况，并进行极体形态学分级统计和活性鉴定。PbⅠ的形态学评估标准参照Ebner等的方法[5]进行，PbⅠ活性鉴定参照刘文华等的方法[6]进行。

1.3 PbⅠ的保存方法

1.3.1 常温及低温保存 去除卵丘细胞后，卵母细胞在TCM199改良培养液中清洗3次，根据形态分类选取含1～2级PbⅠ的卵母细胞移入预平衡的培养液微滴中，分别在4～10 ℃及39 ℃ 2种温度条件下培养，每隔一段时间取部分卵母细胞染色，对其PbⅠ进行活性鉴定。

1.3.2 冷冻和超低温冷冻保存 将含1～2级PbⅠ的卵母细胞移入EG20冷冻液中，平衡7 min；再移至EG40冷冻液并装入直径200～300 μm的微管中；装管完成后，分别立即置于冰箱-20 ℃冰室和直接投入液氮(-196 ℃)冷冻保存。每隔一段时间，取样解冻，进行PbⅠ活性鉴定。

1.4 数据分析

PbⅠ的排出率、形态正常率及存活率等采用SPSS 11.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同体外成熟培养时间下的PbⅠ排出率

由表1可见，在卵母细胞数体外成熟培养过程中，卵丘细胞逐渐扩散，在培养32～36 h后开始排出PbⅠ，培养40 h扩散率最高，PbⅠ排出率也达到最高，为66.7%；随着培养时间的继续延长，卵丘细胞慢慢脱落，扩散率降低，PbⅠ的排出率逐步下降。

表1 不同体外成熟培养时间下的PbⅠ排出率

注：同列数据后标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表2同。

2.2 不同体外成熟培养时间下PbⅠ的形态和活性

卵母细胞体外培养32～36 h间开始有PbⅠ排出，且发现开始排出的PbⅠ中1～2级比例不高。而培养40～44 h 排出的PbⅠ的形态质量较高，其中培养40 h的1～2级比例高达51.7%，3级占30.7%，4级和5级只有17.6%。随着培养时间的延长，PbⅠ的形态完整率明显降低，到52 h时1级和2级PbⅠ比例只有14.8%(表2)。通过形态分级与活性鉴定结果比较发现，1～2级PbⅠ大多具有生物活性，3级以下的活性较差。

表2 不同体外成熟培养时间下的PbⅠ形态分级

2.3 不同保存温度下PbⅠ的形态和活性

由表3可见，39 ℃条件保存2 h，PbⅠ的形态正常且活性良好，保存4 h形态尚正常，但活性显著下降，保存6 h形态开始不正常，且活性基本丧失；4 ℃条件保存20～40 h期间，形态完整率差异不显著，存活率差异显著，PbⅠ仍然保持良好的形态和活性，但保存60 h时，细胞已崩解或消失，完全丧失活性；-20 ℃冷冻保存1周，多数PbⅠ形态完整有活性，保存2～4周形态完整率与活性均呈现显著下降趋势；-196 ℃超低温冷冻保存后，极体形态完整率为97.8%，存活率为 89.1%，均保持在较高水平。

表3 不同保存温度下PbⅠ的存活率和形态完整率

注：相同温度不同保存时间处理数据后标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

PbⅠ的排出时间因物种不同有较大差异。从屠宰场摘取的牛卵巣卵母细胞大多在体外培养16～24 h开始排出PbⅠ[6]；注射绒促性素(HCG)后12 h小鼠排出卵母细胞，这是PbⅠ排出的高峰时段[7]；本试验中猪卵巣卵母细胞在体外培养32～36 h开始排出PbⅠ，40 h PbⅠ排出率达66.7%。伴随着体外培养时间的延长，部分卵母细胞出现退化现象，卵周隙明显增大，超大或超小PbⅠ增多。由于从卵巣吸取的卵母细胞本身成熟度不一致，可以认为通过严格选择卵泡大小和卵母细胞的成熟度，并改善与控制体外培养条件，可望进一步提高卵母细胞成熟的同步性，在体外培养40～44 h时或其他时段能获得更多优质的PbⅠ。

Choi等在小鼠上发现Mos/MAPK基因调控着PbⅠ的大小、活性、退化与生物学功能[8]。在本试验中，39 ℃条件下保存时，猪PbⅠ很快退化致使活性丧失；在4 ℃低温和-20 ℃条件下，PbⅠ存活时间则较长；在-196 ℃超低温条件下保存，能更好地保持PbⅠ的活性。可以推断，低温和超低温可有效降低基因的调控作用，延缓PbⅠ凋亡进程。