利用虎杖药渣生成桦褐孔菌多糖的研究

刘 琳

(青岛农业大学生命科学学院山东省应用真菌重点实验室，山东青岛 266109

白藜芦醇是一种重要的植物抗毒素，具有抗癌、抗病毒等多种功效，在美国、日本等国家被列为保健品，在我国白藜芦醇被制成胶囊，用于调节血脂和抗癌治疗[1-4]。目前，国际市场上对白藜芦醇的需求量与日俱增。白藜芦醇的主要生产方法是从植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc)中提取，在生产过程中产生大量药渣，仅2010年，我国虎杖药渣总量就达2.6万t[5]。部分白藜芦醇残留在药渣中，造成资源浪费。田凤等报道，水提虎杖药渣中残留的白藜芦醇含量达到原药材总量的47%[5]。更为重要的是，这些药渣大多作为废弃物集中堆放、掩埋，或晒干后焚烧处理，造成严重的环境污染[6]，而有关虎杖药渣综合利用的研究却鲜有报道。朱杰等利用虎杖药渣栽培杏鲍菇，杏鲍菇中白藜芦醇含量仅为 4.91 μg/g，产品附加值较低[7]。

桦褐孔菌[Inonotusobliquus(Fr.) Pilat]是一种非常珍贵的药用真菌，早在16世纪，欧洲国家已将其应用于治疗癌症、结核病、糖尿病等疑难杂症[8-9]。多糖是桦褐孔菌的重要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、降血糖等多种生理活性[10-11]。然而，野生桦褐孔菌资源十分稀少，价格昂贵，远不能满足市场需求。液体深层发酵是桦褐孔菌多糖的主要来源途径，同时桦褐孔菌菌丝体含有丰富的人体必需氨基酸，具有较高的营养价值[12]。近年来，对于桦褐孔菌多糖的研究主要集中在药理活性和发酵常规碳、 氮源的优化。笔者利用桦褐孔菌发酵

虎杖药渣生成桦褐孔菌多糖，采用单因素和正交试验获得了最优培养基组成。同时，桦褐孔菌将虎杖药渣中残留的白藜芦醇转化、释放。该方法利用虎杖药渣同时获得高附加值产品桦褐孔菌多糖、白藜芦醇和桦褐孔菌菌丝体，不仅具有较高的经济效益，还能够缓解虎杖药渣引起的环境污染，产生良好的社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桦褐孔菌取自青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室；葡萄糖、苯酚、硫酸等试剂均为分析纯；乙腈为色谱纯。

恒温振荡器购自上海一恒科学仪器有限公司；电子天平购自奥豪斯国际贸易有限公司；752紫外可见分光光度计购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；台式离心机购自赛默飞世尔科技有限公司；高效液相色谱Waters 2690色谱系统购自Waters公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基 种子培养基：KH2PO43 g/L、MgSO415 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖20 g/L、5 g/L麸皮浸汁。

基础发酵培养基：KH2PO43 g/L、MgSO41.5 g/L、蛋白胨5 g/L、虎杖药渣20 g/L、5 g/L麸皮浸汁。

1.2.2 发酵培养 种子培养：将4 ℃冰箱中的PDA斜面菌种转接于PDA平板，28 ℃活化培养5 d。在平板中菌丝生长旺盛处打孔，每个种子培养基中接入3个菌块，发酵培养(28 ℃，120 r/min，3 d)，250 mL三角瓶种子培养基装液量 50 mL。发酵培养：将种子培养基以接种量8%(v/v)接种于发酵培养基，250 mL三角瓶装液量50 mL，28 ℃、120 r/min条件下培养7 d，检测发酵液中的多糖含量。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 麸皮添加量的确定 麸皮浸汁的制备：称取一定质量的麸皮，加入适量自来水，煮沸30 min后用纱布过滤，弃滤渣，滤液定容。制备麸皮添加量分别为5、10、20、30 g/L的麸皮浸汁，利用不同的麸皮浸汁配制培养基，培养基中其他组分及添加量与基础发酵培养基相同。发酵培养结束后，4 000 r/min 离心15min，上清液用蒸馏水定容至50 mL，检测多糖含量，确定最适麸皮添加量。发酵培养方法同“1.2.2”节。

1.2.3.2 碳源的确定 发酵培养基中添加10 g/L的虎杖药渣，在此基础上分别添加麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和玉米粉，添加量为10 g/L。培养基中其他组分及添加量与基础发酵培养基相同。发酵结束后，检测多糖含量，确定最适碳源。发酵培养方法同“1.2.2”节。

1.2.3.3 虎杖药渣添加量的确定 改变基础发酵培养基中虎杖药渣添加量为5、10、15、20 g/L，培养基中其他组分及添加量与基础发酵培养基相同。发酵结束后，检测多糖含量，确定最适虎杖药渣添加量。发酵培养方法同“1.2.2”节。

1.2.3.4 氮源的确定 分别用豆粕、牛肉膏、酵母膏、(NH4)2SO4代替基础发酵培养基中的蛋白胨配制发酵培养基，各种氮源添加量均为0.5%。发酵结束后，检测多糖含量，确定最适氮源。发酵培养方法同“1.2.2”节。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 苯酚-硫酸法检测多糖含量 发酵结束后，4 000 r/min 离心15 min，取发酵液上清用蒸馏水定容至 50 mL。取发酵液上清10 mL，加入4倍体积的无水乙醇，放于4 ℃冰箱中过夜沉降，6 000 r/min离心5 min，弃上清，取沉淀加入10 mL蒸馏水溶解，即为多糖提取液。取多糖提取液1.0 mL于试管中，加入6.0%的苯酚溶液1.0 mL、浓硫酸 5.0 mL，用微型旋涡混合仪摇匀，迅速用流水冷却至室温，在490 nm处检测吸光度，根据标准曲线计算多糖含量。标准曲线方程为y=6.214 9x+0.003 3，r2=0.999 7。

1.2.4.2 白藜芦醇含量 发酵结束后，向三角瓶中加入无水乙醇，使乙醇最终体积分数为70%，冷浸提12 h，取上清，HPLC检测白藜芦醇的含量。色谱柱为Kromasil-C18ID 4.6 mm×250 mm，5 μm，流速为0.7 mL/min，柱温为室温，流动相为水和乙腈。梯度洗脱：0～15 min，乙腈/水(v/v)31 ∶69～50 ∶50；15～20 min，乙腈/水(v/v)50 ∶50～98 ∶2。检测波长为306 nm。

1.2.4.3 桦褐孔菌菌丝体生物量 发酵结束后，4 000 r/min离心10 min后收集菌丝体，60 ℃干燥至恒质量，称质量。

2 结果与分析

2.1 麸皮添加量的确定

由图1可知，添加麸皮后，多糖产量较空白对照明显增加。随着麸皮浸汁中麸皮添加量从5 g/L增加到30 g/L，多糖的产量先增加后减少，当麸皮添加量为1.0%时，多糖产量最高，为(6.87±0.29) g/L。桦褐孔菌是白腐菌，能够同时分泌纤维素酶和木质素降解酶，比霉菌更适合水解天然木质纤维素[13]。纤维素和木质素是虎杖药渣中的主要成分，发酵液中纤维素酶和木质素降解酶的活力越高，越有利于虎杖的降解。麸皮中含有低聚葡萄糖、纤维二糖等诱导物质，能够促进菌体产生大量的纤维素酶和木质素降解酶[14-15]。所以，在培养基中适当地添加麸皮有利于虎杖的降解和多糖的合成，培养基中麸皮过多则对酶的活性具有抑制作用[16]，反而不利于多糖的合成。因此，最适麸皮添加量为10 g/L。

2.2 碳源的确定

为了进一步提高多糖产量，在含有10 g/L虎杖药渣的培养基中分别添加4种补充碳源，添加量为10 g/L。以基础发酵培养基作对照，考察混合碳源对多糖生成的影响(图2)。当麦芽糖、蔗糖、葡萄糖与虎杖的混合物作为碳源时，多糖产量分别为对照(虎杖药渣)的60.59%，59.06%、49.69%；玉米粉作为补充碳源，获得的多糖[(4.70±0.21) g/L]与对照[(4.72±0.19) g/L]相差不大。向超等的研究表明，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖作为碳源，比玉米粉更有利于桦褐孔菌菌丝体和桦褐孔菌三萜的积累[17]。然而，在桦褐孔菌发酵虎杖药渣合成多糖的培养基中，添加这3种速效碳源的效果不如玉米粉。虽然虎杖药渣作为主要碳源(对照)与虎杖和玉米粉的混合碳源相比，获得的多糖产量相差不大，但考虑到虎杖药渣的废物利用，确定碳源为虎杖药渣。

2.3 虎杖药渣添加量的确定

虎杖药渣作为主要的碳源，在培养基中的含量是影响桦褐孔菌多糖积累的重要因素。由图3可知，多糖的产量随着虎杖药渣添加量的增加先增加后减少，当培养基中虎杖药渣添加量为15 g/L时，多糖产量最高，为(6.93±0.24) g/L。当培养基中虎杖药渣添加量超过15 g/L时，多糖产量降低，这是因为虎杖中的多种组分具有一定的抑菌作用[18]，如蒽醌衍生物能够与DNA结合，抑制菌体DNA、RNA以及蛋白质的生物合成；鞣质能使微生物原生质凝固。过量的虎杖药渣抑制了桦褐孔菌的生长，导致多糖产量降低。因此，最适虎杖药渣添加量为1.5%。

2.4 氮源的确定

不同氮源对桦褐孔菌发酵虎杖生成多糖的影响见图4。由图4可知，蛋白胨作为氮源的发酵液中多糖含量最高，为(4.74±0.29) g/L，牛肉膏次之，为(3.03±0.18) g/L。豆粕和(NH4)2SO4作为氮源不利于桦褐孔菌发酵合成多糖，多糖量分别为(0.57±0.16) g/L和(0.36±0.13) g/L，这与张泽生等[19]和周丽洁等[20]的研究结果一致。因此，确定蛋白胨为最适氮源。

改变培养基的蛋白胨添加量，考察氮源浓度变化对多糖产量的影响(图5)。由图5可知，蛋白胨添加量从2 g/L增加到15g/L时，多糖产量先增大后减少。蛋白胨含量从2 g/L 增加到5 g/L时，多糖产量由(2.13±0.21) g/L增加到(4.74±0.19) g/L；蛋白胨含量从5 g/L到8 g/L时，多糖量变化不大；蛋白胨含量从8 g/L到15 g/L时，多糖产量下降为(1.63±0.27) g/L。因此，确定发酵培养基中蛋白胨的最适添加量为5 g/L。

2.5 正交试验优化发酵培养基

以麸皮、虎杖药渣和蛋白胨的添加量为3个因素，各取3个水平，以多糖产量为指标，选L9(33)正交表进行试验，优化发酵培养基(表1)。正交试验极差分析结果(表2)表明，培养基中影响多糖产量的因素主次顺序为B>A>C，即虎杖药渣添加量>麸皮添加量>蛋白胨添加量。3个因素的最优水平组合为A2B2C2，即虎杖药渣添加量为15 g/L，麸皮添加量为10 g/L，蛋白胨添加量5 g/L。因此，桦褐孔菌发酵虎杖药渣生成多糖的优化培养基为KH2PO43 g/L、MgSO41.5 g/L、蛋白胨5 g/L、虎杖药渣15 g/L、麸皮浸汁10 g/L，pH值自然。此条件下，多糖产量为(7.65±0.21) g/L。正交试验方差分析结果(表3)表明，麸皮添加量和虎杖药渣添加量对多糖产量的影响显著。根据F值可知，影响多糖产量的因素主次顺序与极差分析结果一致。

表1 虎杖药渣生成多糖培养基优化的正交试验因素水平

2.6 白藜芦醇和桦褐孔菌菌丝体的获得

利用正交试验获得的发酵培养基进行发酵培养，HPLC法(高效液相色谱法)检测出发酵液中白藜芦醇含量为(1.62±0.14)mg/g虎杖干药渣， 桦褐孔菌菌丝体生物量为(11.79±0.35) g/L。在虎杖中，白藜芦醇主要以白藜芦醇苷的形式存在，白藜芦醇苷由白藜芦醇和葡萄糖通过β-葡萄糖苷键连接构成。纤维素酶中的β-葡萄糖苷酶能够将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇[21]。桦褐孔菌分泌纤维素酶，在利用虎杖药渣的同时，将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇。桦褐孔菌菌丝体含有丰富的人体必需氨基酸，在保健食品领域中具有广阔的应用前景。

表2 虎杖药渣生成多糖培养基优化的正交试验结果(n=3)

表3 虎杖药渣生成多糖培养基优化的正交试验方差分析

3 结论

本试验利用桦褐孔菌发酵虎杖药渣生成桦褐孔菌多糖。通过单因素试验确定发酵培养基中最适麸皮添加量为 10 g/L，最适虎杖药渣添加量为15 g/L，最适氮源为蛋白胨，添加量为5 g/L。在此基础上，采用正交试验优化发酵培养基。最优培养基组成为KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，蛋白胨 5 g/L，虎杖药渣15 g/L，10 g/L麸皮浸汁。此条件下，多糖产量为(7.65±0.21) g/L，白藜芦醇为(1.62±0.14) mg/g，桦褐孔菌菌体生物量为(11.79±0.35) g/L。该方法以虎杖药渣废弃物作为主要碳源，变废为宝，原料利用度高，发酵废渣少，发酵产品价值高，具有可观的社会效益、经济效益和产业化前景。