古旱莲内生细菌多样性及产酶活性鉴定

兰阿峰， 郭素芬， 王 菲， 邓百万， 刘开辉

(1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723001； 2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中 723001

木兰科木兰属植物古旱莲(MagnoliadenudateDest var.purpurascensRehd et Wils)产于中国，是国家Ⅱ级重点保护野生植物[1]。木兰科植物木兰(MagnolialilifloraDest.)、玉兰(MagnoliadenudataDesr.)、厚朴(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.)、木莲(ManglietiafordianaOliv.)、鹅掌楸(Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.)[2]中许多种类是我国的传统药材。紫玉兰(Magnolialiliiflora)、玉兰(Magnolialiliiflora)、望春玉兰 (Magnoliabiondii)、武当木兰(Magnoliasprengeri)在中药中统称辛夷，其干燥花蕾有通鼻消炎、治疗妇科病及抑制真菌等作用[3]。厚朴、凹叶厚朴(Magnoliaofficinalissp.Biloba)、长喙厚朴(Magnoliarostrata)在中药中统称厚朴，是木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、枝皮或根皮，是我国重要的传统中药。木兰科植物的鹅掌楸属、五味子属和木兰属的厚朴、凹叶厚朴都属于国家保护植物，已被列为濒危药用植物，其资源已经非常有限。近年来，随着老药新用的提出，厚朴具有的抗病毒、抗肿瘤、抗菌、防龋、抗溃疡、镇痛抗炎等作用及其他新的药理药效不断被发现[4-5]。目前已经从木兰科中的鹅掌楸属、五味子属和木兰属的玉兰、厚朴、凹叶厚朴中分离出大量内生真菌，但并未发现其代谢产物对多种病原菌具有很强的抑制作用[6-10]。木兰科植物内生细菌多样性及功能鲜见研究报道。

植物内生细菌是指能够从表面消毒后的植物组织内分离到或者从植物内提取到，并且对植物不造成可见危害的细菌[5]。陕西省汉中市勉县武侯祠的资料显示，1979年文物普查时，发现一棵木兰科植物古旱莲，北京林业学院专家用14C 测定其树龄为400多年，非常具有研究价值。古旱莲由于其稀有性，在内生细菌分离及产酶活性等方面还未见报到。本研究以勉县武侯祠古旱莲为研究材料，旨在探究勉县武侯祠古旱莲内生细菌的物种多样性，发掘产酶活性菌株。本研究对进一步深入研究和阐明古旱莲内生细菌的群落分布、物种多样性及其开发利用等方面具有理论意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 2015年11月中旬，在陕西省汉中市勉县武侯祠的工作人员修剪400年生古旱莲时，采集直径约为 2 cm的茎组织，放入无菌袋带回实验室于4 ℃下保存，材料在2周内处理完毕，用于内生细菌的分离。

1.1.2 试剂 蛋白胨(纯度≥99.5%，天津市盛奥化学试剂有限公司)、酵母粉、NaCl、琼脂粉(纯度≥99.5%，北京奥博星生物技术有限责任公司)，2×TaqPCR Master Mix、PCR引物等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 仪器 凝胶扫描成像系统(GelDoc，美国Bio-Rad公司)、PCR扩增仪(Mycycler，美国Bio-Rad公司)、移液器系列(Eppendorf，德国Eppendorf公司)。

1.1.4 分离培养基 LB培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉 5.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂粉12.0 g、水1 L，pH值自然；液体LB培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、NaCl 10.0 g、水1 L，pH值自然。

1.1.5 酶活性筛选培养基

1.1.5.1 蛋白酶筛选培养基 牛肉粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、脱脂高蛋白奶粉20.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20.0 g、水1 L[11]。

1.1.5.2 淀粉酶筛选培养基 酵母粉5.0 g、蛋白胨5.0 g、可溶性淀粉20.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20.0 g、水1 L。卢氏碘液[12]。

1.1.5.3 纤维素酶筛选培养基 蛋白胨10.0 g、酵母粉 10.0 g、羧甲基纤维素钠10.0 g、KH2PO41.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20.0 g、水1 L[13]。刚果红染液(1 000 mg/L)，NaCl水溶液(58 500 mg/L)。

1.1.5.4 脂肪酶筛选培养基 蛋白胨10.0 g、(NH4)2SO42.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO43.0 g、FeSO4·7H2O 1.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20.0 g、水1 L，溴甲酚紫0.04 g[14]，PVA-橄榄油乳化液120 mL。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离与纯化 参照文献[15]的方法，取新鲜古旱莲茎组织，用自来水冲洗2 h左右。在超净工作台中，用75%乙醇浸泡30 s后，无菌水冲洗5次；然后用0.1%氯化汞浸泡3 min，无菌水冲洗5次。取最后1次无菌水洗涤上清液100 μL，涂布于LB平板，作3个空白对照，37 ℃培养1～3 d，检测材料表面消毒是否彻底。用无菌剪刀将韧皮部切割成0.5 cm2左右的小块，接种于LB培养基上，每个平皿内接种4个组织块。封口膜封口，37 ℃倒置培养1～3 d，待材料周围内生细菌长出后，选择菌落边缘部分挑取划线纯化，接入液体LB培养基中，在37 ℃、160 r/min条件下培养8 h，转入离心管中，于4 ℃下保存。

1.2.2 分离菌株的系统发育分析 以细菌通用引物27F/1492R进行菌落PCR，预期扩增长度为1 500 bp，反应体系(30 μL)：2×TaqPCR Mix 15 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 12 μL。反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共33个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶检测后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。所得序列提交到NCBI数据库中，进行Blast检索，整理序列，发往NCBI，获得菌株登录号。最后将序列提交到Basic Local Alignment Search Tool (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Blast检索，下载相似性较高的序列数据，生成Fasta格式文件。用Clustal-X[16]软件对所得序列进行人工校正及比对分析。利用MEGA5.1[17]，按照Neighbor-Joining法聚类，选择1 000个重复做Bootstrap值分析，构建系统发育树[18]。

1.2.3 多样性指数 多样性指数(H′)可以反映每种植物内生真菌的物种多样性程度，按Shannon-Weiner指数计算[19]。

式中：Pi指某种内生真菌的菌株数占全部内生真菌菌株数的百分数；k表示内生真菌菌株数量。

1.3 胞外酶产生菌的筛选

1.3.1 蛋白酶筛选方法 在无菌条件下，将膜过滤的脱脂高蛋白牛奶加入灭菌后的肉汤培养基中倒平板。穿刺接种后37 ℃培养，待菌落生长到1 cm时测量降解圈直径。

1.3.2 淀粉酶筛选方法 使用淀粉酶筛选培养基平板，无菌条件下穿刺接种后37 ℃培养，待菌落生长1 cm时缓慢地将卢戈式碘液覆盖培养基，染色1 min后测量降解圈直径。

1.3.3 纤维素酶筛选方法 使用纤维素酶筛选培养基平板，无菌条件下穿刺接种后37 ℃培养，待菌落生长1 cm时缓慢加入刚果红染液(1 000 mg/L)覆盖培养基染色3 min，再用NaCl水溶液(58 500 mg/L)侵泡脱色3 min后测量降解圈直径。

1.3.4 脂肪酶筛选方法 按脂肪酶筛选培养基配制培养基，灭菌后加入PVA-橄榄油乳化液120 mL摇匀倒平板，无菌条件下穿刺接种后37 ℃培养，待菌落生长1 cm时，测量黄色降解圈直径。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离

最后一次冲洗用灭菌去离子水涂布LB平板，37 ℃培养1～3 d，平板上无菌落则表明经表面消毒后，样品表面附生菌影响已消除。共分离纯化细菌52株，菌种在4 ℃下保藏。在陕西省汉中市勉县武侯祠采集古旱莲材料，在12 h内将样品带回实验室并在1周内处理，进行内生细菌的分离工作，在一定程度上避免了因为人为因素对试验结果造成的影响，保证内生细菌较为完全的分离。

2.2 分离菌株的系统发育分析

2.2.1 旱莲内生细菌16S rRNA序列特异性扩增 分离纯化旱莲内生细菌，应用细菌16S rRNA序列通用引物进行特异性扩增，得到约1 500 bp的目标片段，见图1。切胶回收目标条带可消除非特异性片段的影响。

2.2.2 内生细菌的分子生物学鉴定 获得分离内生细菌的登录号为KR149373～KR149424。本研究较系统地阐述了古旱莲内生细菌的多样性，采用传统培养方法共分离得到古旱莲内生细菌52株，分子生物学归类为18个属。根据测序结果不同，将菌株归为19个分类单元(OTUs)，这些菌株分属4个门，拟杆菌门(Bacteroidetes)下属1个单元，占总数的 7.7%，鞘胺醇杆菌属(Sphingobacteriumsp.)4株；厚壁菌门(Phylum Firmicutes)下属5个单元，占总数的15.4%，分别是游动球菌属(Planococcussp.)1株，葡萄球菌属(Staphylococcussp.)2株，芽孢杆菌属(Bacillussp.)3株，类芽孢杆菌属(Paenibacillussp.)1株，德库菌属(Desemziasp.)1株；变形菌门(Proteobacteria)下属5个单元，占总数的 19.2%，分别是不动杆菌属(Acinetobactersp.)3株，假单胞菌属(Pseudomonassp.)1株，埃希氏菌属(Escherichiasp.)4株，克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)1株，克罗诺斯菌属(Cronobactersp.)1株；放线菌门(Actinobacteria)下属7个单元，占总数的40.4%，分别是库克菌属(Kocuriasp.)6株，微球菌属(Micrococcussp.)5株，微杆菌属(Microbacteriumsp.)3株，短杆菌属(Brevibacteriumsp.)4株，海迪茨氏菌属(Dietziasp.)1株，放线菌属(Actinobacteriumsp.)1株，微球菌科(Micrococcaceae)1株；未培养细菌9株，占总数的17.3%。在门的分类上，优势菌群为放线菌门(Actinobacteria)，在属的分类上，优势菌群为库克菌属(Kocuriasp.)。古旱莲内生细菌16S rRNA序列同NCBI数据库中相关序列相似性为 82%～100%，具体见表1。

表1 古旱莲内生细菌16S rRNA基因序列多样性对比

2.2.3 细菌16S rRNA系统发育分析 使用细菌通用引物27F/1492R通过PCR扩增所分离细菌的16S rRNA序列片段，下载相似序列构建系统发育树，系统发育将52个种属归为4个门，拟杆菌门包含鞘胺醇杆菌属1个类群，约占总数的7.7%；厚壁菌门包含游动球菌属，葡萄球菌属，芽孢杆菌属，类芽孢杆菌属，德库菌属5个类群，约占总数的15.4%；变形菌门包含不动杆菌属，假单胞菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，克罗诺斯菌属5个类群，约占总数的11.5%；放线菌门包含库克菌属，微球菌属，微杆菌属，短杆菌属，海迪茨氏菌属，放线菌属，微球菌科7个类群，约占总数的40.4%，是最优势类群；未培养细菌9株，占总数的17.3%。

根据细菌16S rRNA序列构建系统发育树，见图2。拟杆菌门下属1个OTU，鞘胺醇杆菌属的代表菌株HL-B3与未培养细菌的代表菌株HL-B23聚在一处，代表菌株与已知序列的相似度为99%；厚壁菌门下属5个OTU，游动球菌属的代表菌株HL-B8与葡萄球菌属的代表菌株HL-B28、芽孢杆菌属的代表菌株HL-B29、类芽孢杆菌属的代表菌株HL-B44、德库菌属的代表菌株HL-B54在进化树上聚在一处，代表菌株与已知序列的相似度在97%以上；变形菌门下属5个OTUs，不动杆菌属的代表菌株HL-B11与假单胞菌属的代表菌株HL-B16、埃希氏菌属的代表菌株HL-B30、克雷伯氏菌属的代表菌株HL-B75、克罗诺斯菌属的代表菌株HL-B65在进化树上聚在一处，代表菌株与已知序列的相似度为99%；放线菌门下属7个OTUs，库克菌属的代表菌株HL-B6与微球菌属的代表菌株HL-B7、微杆菌属的代表菌株HL-B14、短杆菌属的代表菌株HL-B18、海迪茨氏菌属的代表菌株HL-B67、放线菌属的代表菌株HL-B72、微球菌科的代表菌株HL-B81在进化树上聚在一处，代表菌株与已知序列的相似度在82%以上。

2.2.4 古旱莲内生细菌的多样性指数 根据多样性指数公式，计算古旱莲内生细菌的多样性指数为2.666 6。多样性指数越高说明物种的多样性越丰富。Klopper等的研究采用4种不同的培养基分离木兰科植物内生真菌，多样性指数在 1.33～1.81之间[20]，与本研究相比，古旱莲内生细菌的多样性是十分丰富的。

2.3 胞外酶产生菌的筛选

产蛋白酶菌株筛选：将纯培养后的单菌落菌液穿刺接种至蛋白酶筛选培养基，37 ℃培养12 h，得到分解透明圈即是产蛋白酶菌株，共22株。

产淀粉酶菌株筛选：将纯培养后的单菌落菌液穿刺接种至淀粉酶筛选培养基，37 ℃培养12 h，使用卢氏碘液染色，可见白色透明圈即是产淀粉酶菌株，共3株。

产纤维素酶菌株筛选：将纯培养后的单菌落菌液穿刺接种至纤维素酶筛选培养基，37 ℃培养12 h，使用刚果红(1 000 mg/L)染液染色5 min，再用NaCl(58 500 mg/L)脱色5 min。得到的透明圈即是产纤维素酶菌株，共7株。

产脂肪酶菌株筛选：将纯培养后的单菌落菌液穿刺接种至脂肪酶筛选培养基，37 ℃培养12 h，菌落产生的脂肪酶将脂肪降解为脂肪酸使溴甲基紫变为黄色，即是产脂肪酶菌株，共4株，结果见表2。

3 结论与讨论

药用植物内生细菌的研究日渐增多，如红豆杉[20]、苦豆子[21]、沙冬青[22]等，但对木兰科植物内生细菌的研究依旧较少。本研究发现，古旱莲分离内生细菌52个株，可归为4个门，拟杆菌门包含鞘胺醇杆菌属1个类群，约占总数的 7.7%；厚壁菌门包含游动球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、德库菌属5个类群，约占总数的15.4%；变形菌门包含不动杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、克罗诺斯菌属5个类群，约占总数的11.5%；放线菌门包含库克菌属、微球菌属、微杆菌属、短杆菌属、海迪茨氏菌属、放线菌属、微球菌科7个类群，约占总数的40.4%，是最优势类群；未培养细菌9株，占总数的17.3%。本研究分离到的细菌以放线菌为最优势类群，这可能与试验材料，培养基等因素相关。本研究分离到9株未培养菌，分类地位目前不明确，有待于进一步的研究。利用传统方法研究植物内生菌分离得到的内生菌数量及种类是有限的，须要结合免培养方法才能更为有效地了解植物内生菌的群落结构。目前国内外对植物内生菌资源的研究取得了一定的进展，但相对于我国丰富的药用植物资源来说，对其内生菌资源的开发和利用还是远远不够的[23]。

据统计我国药用植物有11 146种，药用植物作为一类特殊的植物其内生环境具有一定的特殊性[24]。全面系统地对药用植物内生菌资源及其活性代谢产物进行研究是非常有必要的。研究植物内生细菌的目的在于应用，自黄瓜、棉花等植物体内的细菌和宿主植物的抗病能力关系[22]被发表以来，很多研究人员开始致力于植物体内的细菌研究，至今在植物保护方面积累了大量的植物内生细菌研究信息[23-25]。本研究分离到的内生细菌与植物之间的关系还需要进一步深入探讨。

植物内生细菌研究的另一个热点则在生理活性物质研究领域[26]。分离自古旱莲中的内生细菌有一部分能够分泌胞外淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶，而且有些菌株还具有同时分泌其中2种水解酶的能力，这种产酶特性可能与其适应独特的生活环境有关。目前已经从木兰科植物五味子中分离出内生拮抗细菌[27-28]。本研究鉴定的3株高产酶活性菌株中，1株产淀粉酶为类芽孢杆菌，2株产蛋白酶为微杆菌，说明古旱莲内生类芽孢杆菌和微杆菌可能具有重要的工业酶开发价值。

表2 古旱莲内生细菌产酶活性筛选

注：+表示0～2 cm；++表示2～5 cm；+++表示 >5 cm；-表示无结果。

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