高效纤维素降解菌株筛选及其复合微生物菌剂在有机堆肥中的应用效果

岳 丹， 王 磊， 乔莉娟， 李丹花， 昝立峰

(1.邯郸学院实验与实训中心，河北邯郸 056005； 2.邯郸学院生命科学与工程学院，河北邯郸 056005

随着我国社会经济的进步以及人口的增长，农业和畜牧业持续健康发展，规模不断壮大，我国国民生活水平得到有效改善。但是在粮食种植和畜禽养殖过程中产生了大量作物秸秆、玉米芯、畜禽粪便等各类有机废弃物，对我国空气、水、土壤等都造成了严重的污染和危害[1]。鉴于自然排放的畜禽粪便等废弃物对环境的污染和危害，目前国际上对其主要以无害化、资源化的原则进行处理。目前采用的方法有生产沼气能源，制作发酵饲料和高温堆肥技术等。其中高温堆肥技术以其无害化程度高、腐熟程度好、处理规模大、成本较低等优点逐渐成为畜禽粪便处理的首选[2]。

堆肥是一个有机物生物分解的过程，分为4个阶段，即中温、高温、降温、成熟熟化阶段[3]。在此过程中，微生物群落结构不断变化，易氧化的有机质变成更加稳定的有机质，最终形成堆肥产物。堆肥产物已经被广泛用作土壤调节剂和土壤肥料[4]，在改善土壤肥力和抵抗病菌方面具有巨大潜能。研究表明，在微生物参与的堆肥生产过程中，最初的碳氮比在(25～30) ∶1之间被认为是堆肥生产的最佳条件[5]，所以畜禽粪便堆肥中常常加入作物秸秆来调节物料最初的碳氮比[6]，这也有利于农业有机废弃物的资源化利用。虽然很多研究表明接种外源微生物菌剂可以促进堆肥进程，加快堆肥的腐熟[7-9]，但是堆肥混合物料中的纤维素降解缓慢，一直是影响堆肥产品稳定性的重要因素。通过在堆肥过程中添加高效纤维素降解菌可以有效促进纤维素的降解，加快堆肥腐熟和稳定。因而，筛选和鉴定具有高效纤维素降解能力的菌株、制备微生物菌剂，是提高高纤维堆肥稳定性的重要手段[10-12]。

本研究从竹林表层土壤筛选高效纤维素降解菌，将多种菌株混合制备成复合微生物菌剂并添加到堆肥原料中进行高温发酵，研究菌剂的堆肥效果，为构建高效降解纤维素的复合微生物菌剂提供菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种分离材料来自河北省邯郸市竹林表层土壤。采集样品时取1 g土壤放入无菌锥形瓶中，加入玻璃珠振荡培养1 h备用。

1.2 菌株的筛选

将土壤样品制成不同稀释倍数的菌悬液，分别接种至羧甲基纤维素钠平板中进行恒温培养，将所得菌株多次划线分离，得到的菌株纯培养。将所分离菌株点接于纤维素刚果红培养基中，量取并计算菌株透明圈直径(D)和菌圈直径(d)的比值，即为HC比值。

1.3 菌株的鉴定

分别提取细菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，以27F和1 492R为16S rDNA的引物进行细菌基因组DNA的PCR扩增[13]。PCR产物通过琼脂糖凝胶回收试剂盒(Solarbio公司)回收目的条带，连接到pGM-T载体(Solarbio公司)，转化到大肠杆菌(Escherichiacoli) DH5α感受态细胞中，将阳性重组子送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。将得到的序列通过BLAST软件与GeneBank中相关序列进行比对，并利用MEGA 5.0软件进行聚类分析构建进化树。

1.4 微生物菌剂的制备

将分离纯化的纤维素降解菌株分别置于25 ℃、150 r/min 的摇床中进行液体发酵培养，待菌量达到 108个/mL 时，取菌株的菌悬液分别按照体积比等比例混合，制成微生物菌剂备用。

1.5 堆肥试验

将猪粪和秸秆混合后调节碳氮比至(25～30) ∶1之间，水分控制在60%左右。试验共分为菌剂组、对照组这2组，每组3次重复，每组物料初始质量均为20 kg。

菌剂组为每千克物料喷施5 mL自制菌剂并混合均匀[14]。对照组只添加相同体积的无菌水。菌剂和物料充分混匀后分别放置于泡沫箱中，每3 d翻堆1次。

1.6 指标测定

试验期间每天09：00和16：00分别在距堆体表面10 cm处测量温度，取温度平均值作为堆体温度。总有机碳含量采用重铬酸钾容量-外加热法测定，总氮含量采用凯氏定氮法测定[15]。碳氮比(C/N)为总有机碳含量和总氮含量的比值。纤维素降解率的测定参照刘旭的测定方法[16]。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选及鉴定

通过羧甲基纤维素钠平板法和刚果红染色法的初步筛选和纯化，共得到5株菌株。对菌株进行形态学观察并测定菌株圈直径与菌落直径的比值(HC)，由表1可知，5株菌株具有细菌的典型形态特征，且均具有明显的透明圈，具备降解纤维素的能力。

表1 菌株的形态特征

菌株L1、L2、L3、L4、L5的16S rDNA测序长度分别为997、968、672、1026、940 bp。将序列在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，简称NCBI)的Blast软件中进行同源性比对，在GeneBank中下载同源性高的菌株序列构建系统发育树。由图1可知，菌株L1、L2为小麦苍白杆菌(Ochrobactrumtritici)，L3为中华根瘤菌属(Sinorhizobiumsp.)，L4为绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)，L5为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。堆肥是微生物参与的高温发酵过程。相对真菌而言，细菌具有更快的生长速率和更高的温度耐受力，在堆肥的稳定和腐熟中发挥重要作用[17]。因此，采用筛选出的具有高效纤维素降解能力的细菌制备微生物菌剂，可以增加堆肥中微生物的数量、堆肥中有机质和纤维素的降解效率，增强堆肥稳定性。

2.2 3堆肥的温度变化

将制备的微生物复合菌剂添加到堆肥中进行堆肥试验，每天定时测定堆体温度，得到堆肥生产过程中的温度变化情况。由图2可知，接种复合微生物菌剂的菌剂组堆体的最高温度为62.2 ℃，高于对照组堆体(最高温度为58 ℃)；菌剂组、对照组堆体温度维持在50 ℃以上的时间分别为10、7 d，堆体升温到最高温度所用时间分别为6、9 d，温度降至40 ℃以下所用时间分别为21、27 d。在堆肥生产过程中，微生物将有机物质发酵，降解至堆肥腐熟。温度是该过程中影响微生物新陈代谢最主要的因素，也是影响堆肥效果和堆肥产品质量的重要参数[5]。研究表明，堆肥原料堆体温度处于50 ℃以上的时间必须保持在5～7 d，以确保病原体的有效灭活[18]。这说明菌剂组和对照组堆肥均达到了腐熟无害化的标准，但是接种复合微生物菌剂可以提高堆肥温度，缩短堆肥周期，保证堆肥质量。

2.3 堆肥碳氮比值的变化

在堆肥过程中，随着有机物的降解，碳氮比(C/N)不断发生变化[19]。由于C/N与堆肥过程中的许多化学特性有关，所以C/N是描述不同堆肥稳定性最合适的参数[20-21]。由图3可知，随着堆肥的发酵，C/N逐渐降低。菌剂组C/N从最初的30下降到15.4，对照组从最初的30.6下降到18。有研究表明，当堆肥的C/N低于20时，有机物达到稳定状态，堆肥腐熟[22]。由此可见，菌剂组和对照组堆肥均达到腐熟标准，且菌剂组比对照组先达到腐熟。在堆肥过程中，菌剂组堆肥C/N呈先升高再降低的趋势，整体呈下降趋势，这可能是由于高温增加了氨的排放量，导致较高的氮素损失，从而使难分解的有机物质的降解速率减缓，使得一定时期C/N相对较高[8，23]。

2.4 堆肥的纤维素含量变化

堆肥的纤维素含量变化是反映堆肥处理效果的直接指标，结果如图4所示。30 d时，菌剂组堆肥纤维素降解率为24.7%，对照组堆肥纤维素降解率为17.3%，这说明接种复合菌剂能够降低堆肥中的纤维素含量。

3 结论

本试验中筛选得到5株高效纤维素降解菌株，将菌株L1、L2、L3、L4、L5的16S rDNA序列在NCBI的Blast软件中进行同源性比对，确定L1和L2为小麦苍白杆菌，L-3为中华根瘤菌属，L-4为绿针假单胞菌，L5为枯草芽孢杆菌。

将制备的微生物复合菌剂添加到堆肥中进行堆肥试验，结果表明，接种复合微生物菌剂的菌剂组、对照组堆体最高温度分别为62.2、58 ℃，50 ℃以上的时间分别为10、7 d，C/N分别从30、30.6下降到15.4、18；菌剂组和对照组堆肥均达到了腐熟无害化标准，但是接种复合微生物菌剂可以提高堆肥温度，缩短堆肥周期，保证堆肥质量。

在堆肥试验中，为了适应微生物的生长需要，加入了作物秸秆作为调理剂调节堆肥物料最初的C/N[6]。作物秸秆中的纤维素是堆肥中的难降解物质，堆肥试验结果表明，30 d时菌剂组、对照组堆肥纤维素含量分别降至24.7%、17.3%，复合微生物菌剂可以高效降解堆肥中的纤维素，促进堆肥进程。