基因编辑技术的新进展及展望

李 莉， 任红艳， 毕延震， 华文君， 华再东， 张立苹， 郑新民

(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064)

基因编辑技术可以让科学工作者对特定基因进行编辑改造，如进行突变、敲除，或进行基因的定点整合等，为分子生物学技术进行基因功能研究、物种改良与改造提供了机遇和条件。基因编辑技术经过初期的同源重组，历经锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术，发展到现在广泛使用的规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)及其相关蛋白(Cas)技术，使得任意物种、任意细胞的基因编辑成为可能。因此，基因编辑技术的应用更为广泛，其影响力也更为强劲，已经在畜牧业中应用于多种动物的基因改造和改良[1]，甚至应用于人类细胞基因的编辑和基因治疗等。然而，目前广泛应用的CRISPR/Cas9技术由于其固有的缺陷，使其更为精确的基因编辑和任意基因的编辑受到阻碍。因此，科学工作者需要寻找新的、更为可靠的基因编辑技术。本文就对基因编辑技术的最新进展加以介绍，并对未来的基因编辑技术加以展望。

1 CRISPR/Cas技术的改进与新应用

CRISPR/Cas系统是细菌的免疫系统，可对抗入侵的病毒。细菌CRISPR能识别入侵的病毒序列，引导Cas蛋白对病毒基因进行切割。CRISPR/Cas系统包含3类，最常用的是二类的CRISPR/Cas9[2-3]。科学工作者对CRISPR/Cas9系统进行了改良，使它适用于各种生物细胞。CRISPR/Cas9仅利用一小段RNA(称为gRNA)识别并引导Cas9对目标基因组特定序列切割，经过细胞自身的基因修复(包括同源重组和非同源末端连接)，最终产生插入、切除等突变。该技术简单易用，已经广泛应用于从细菌到人的基因编辑[1，4-5]。美国哈佛大学科学家采用CRISPR/Cas9技术，破坏了猪细胞基因组中的62个潜在的有害PERV(猪内源逆转录病毒)位点序列，这极大地促进了猪作为异体移植器官的应用研究，使人们不再担心猪病毒序列对人类的危害[6]。但是CRISPR/Cas9存在一些限制因素，如切割的基因识别3′末端部位必须含有NGG这种初始间隔区临近序列(PAM)、存在脱靶现象即不在目标序列进行切割等[7-8]，限制了该技术的进一步应用。科学工作者就针对这些问题进行了研究和改进，并发展了该技术的一些新应用。

为了减少CRISPR/Cas9的脱靶效应，双切口技术是一个进步双切开技术，可以使Cas9在靶序列的两端同时切割，使切割部位有所限制。Ran等发明了双切口技术[8]。该技术是在目标序列的上下各设计1个gRNA，成为1对gRNA。成对的gRNA引导Cas9产生双切口，从而增强CRISPR/Cas9的切割效率、减少脱靶效应。目前的CRISPR/Cas9技术已经普遍采用双切口设计。

双切开技术虽然提高了靶位点的编辑效率，但是依然无法完全解决CRISPR/Cas9技术的脱靶问题。那么，就需要针对该系统进行改良，如对切割酶的改进、对引导序列的改进等。科学家努力进行Cas9的改良或者寻找新的切割蛋白，以改进CRISPR/Cas系统的特异性和适用性。Kleinstiver等突变了原始的酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)，使其成为具有较高特异性的突变体，得到的D1135E SpCas9突变体可以改进Cas9的特异性，同时还改变了其PAM序列要求，可以切割具有NAG和NGA PAM的序列[9-10]。进一步对SpCas9进行改良，获得了eSpCas9和SpCas9-HF突变体。这些突变体能够降低突变体蛋白与目标DNA之间的非特异结合。与野生型比较，在单个gRNA的引导下，超过85%的SpCas9-HF1可以保持在目标序列部位。采用标准的sgRNA靶定非重复序列，Cas9-HF1几乎可以排除任何脱靶事件[10]。Cas9-HF1如果能够被普遍应用的话，就可以大大提高研究者对目标基因的编辑能力，而且能够降低脱靶效应。然而，目前Cas9-HF1尚在部分实验室进行研究，并未大面积推广。人们也要考虑Cas9-HF1是不是在不同物种的不同类型细胞中都有如此之高的工作效率，也许还要进一步的改进。

对Cas9的改造还有改变其切割能力等，例如使其成为DNA单链切割酶，或仅利用其作为结合目标部位的蛋白而与其他DNA切割酶重组。一些研究者就使Cas9突变成为切口酶Cas9n[4，8，11]，这种酶仅在DNA上产生一个单链的切口，而不是双链断裂。这些突变体是RuvC或HNH突变体，在成对的gRNA引导下，通过成对的单链切口，产生同源重组或非同源的末端连接，产生基因的突变，其同源重组效率与原始的Cas9相同，但脱靶效应降低了50～1 500倍，用4个gRNA，针对基因区域上下各1对，Cas9n在HEK 293FT细胞中可引起6 kb的基因去除[8，11]。也有科研人员使失去切割活性的Cas9(dCas9)与其他DNA切割酶如FokⅠ结合，构成融合的重组酶dCas9-FokⅠ，称为RNA引导的FokⅠ核酸酶(RFN)[12-14]。FokⅠ是非特异性的核酸内切酶，已经在锌指核酸酶(ZFN)和TALEN中得到应用[1]。这是利用dCas9在gRNA引导下与目标位点结合，从而用FokⅠ进行切割，该方法与Cas9n相比较，特异性稍强[13]。这只是改进，但脱靶问题依然存在。

CRISPR/Cas9系统中的Cas9识别具有NGG的PAM位点。但在某些情况下，基因组特定部位缺乏该PAM，就使得Cas9无法应用。因此，需要新的Cas蛋白，使科研人员对任意基因组序列能够进行编辑。一种方法就是Cas9基因突变，另一种方法就是寻找新的替代蛋白。经过基因工程改良，现在已经有识别多种PAM的改进型Cas9蛋白[15-17]，如 VRQR-SpCas9、VRER-SpCas9、EQR-SpCas9来源于原始的SpCas9，分别识别NGA、NGCG和NGAG位点。在不同细菌中存在的Cas9具有不同的识别位点特异性。科学家发现一些细菌的Cas9[15-16]，如嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9(StCas9)-CRISPR1识别N2AGAAW(W=A/T)，SthCas9-CRISPR3识别NGGNG；金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的SaCas9识别N2GRRT(R=A/G)，SaCas9的突变体KKH-SaCas9识别N2NRRT(R=A/G)；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)的NmCas9识别N4GMTT(M=A/C)；侧孢芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)Cas9(BlatCas9)识别N4CND(D=A/G/T)；新凶手弗氏菌(Francisellanovicida)的FnCas9识别NGG，其RHA突变体识别YG(Y=C/T)；氨基酸球菌Acidaminococcussp. BV3L6和毛螺菌LachnospiraceaebacteriumND206的Cpf1(AsCpf1和LbCpf1)识别TTTN[17]。利用AsCpf1和LbCpf1已经在人和小鼠细胞中进行了基因编辑，并且已经获得了基因编辑的小鼠[18-19]，其脱靶率低于Cas9，但编辑效率也略低于Cas9。通过原有Cas9的改进和新的Cas蛋白使得CRISPR技术中识别位点的限制得到部分改善，人们可以有一定的随机性来选择靶位点。但是，同一个Cas蛋白只能识别一个PAM位点，针对不同位点需要不同的Cas蛋白。这依然不能做到对任意基因序列的编辑，科学工作者还要不断探索，寻求新的基因编辑工具。

除了改变Cas9蛋白外，改进向导RNA(gRNA)的序列和结构也是改善CRISPR/Cas系统的途径[20]。目前，gRNA含有约20个碱基目标序列的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA，可组成1个单链RNA(sgRNA)，易于设计与合成。不同的核酸酶需要不同的sgRNA[16，21]。sgRNA可以在体外由RNA聚合酶合成，也可以在U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子的驱动下，在细胞内合成。不同的sgRNA引导的基因编辑效率不同，一些sgRNA甚至难以奏效。Liu等测试了218个sgRNA，但其中89个没有作用。引起脱靶的原因包括染色质结构、向导RNA的核酸组成及其长度等[22]。Nowak等介绍了对sgRNA的一些修饰，包括对前后序列、茎环、间隔序列等的增加、减少和改变[21]。Xu等对sgRNA的脱靶效应进行了物理学研究，认为Cas9的切割与sgRNA的折叠有关，并且发展了一个新的预测sgRNA脱靶效应的工具[23]。研究者可以利用该网站进行预测，选择特异性强、效率高的sgRNA，促进基因编辑工作。

研究者还对CRISPR/Cas9系统的应用手段或者方法进行了改进，以促进该系统的编辑效率。利用CRISPR/Cas9系统时，最初的方法是Cas9和sgRNA进行共注射。人们把Cas9质粒或体外合成的mRNA或者重组的蛋白质，与体外转录的sgRNA或sgRNA质粒一起注射或转入细胞或者胚胎。但是，Ablain等设计了一个更为巧妙的质粒[24]。在这个质粒中，有U6启动子驱动sgRNA合成，有组织特异启动子驱动Cas9表达，有广泛表达的报告基因gfp。只要改变载体中的目标基因的sgRNA序列及组织特异启动子序列，就可以在任何组织细胞中特异性地进行基因编辑。Miller等报导了一种新材料，即两性离子氨基酸脂类(ZALs)，可以同时输送长片段RNA，如Cas9 mRNA和sgRNA；ZAL的纳米颗粒(ZNP)可以向细胞输送低浓度的sgRNA(15 nm)而减少90%以上的蛋白质表达；ZNP介导的低浓度(体外<600 pmol/L、体内 1 mg/kg)的mRNA转移，却引起蛋白质的大量表达；采用静脉注射，利用ZNP介导Cas9 mRNA和sgLoxP，在floxed tdTomato转基因小鼠的肝、肾和肺中实现了报告基因tdTomato的表达[25]。这使得采用CRISPR技术进行基因治疗更为方便。

CRISPR/Cas系统不仅可以用于单基因的编辑和改变，还可以同时进行多个基因的修饰和编辑。Yan等报导了一个新的基因编辑策略，建立了一个质粒，使多个基因的sgRNA和shRNA在U6启动子驱动下在细胞内表达[26]。细胞中的核糖核酸酶Ⅲ Drosha可以把sgRNA-shRNA剪切开来，sgRNA引导Cas9进行DNA双链切割，shRNA干扰其mRNA。他们对3个基因同时编辑的效率是9%。引入DNA连接酶IV(LIG4)的shRNA后，以同源修复(HDR)为基础的精确基因编辑效率提高了2倍。哈佛大学学者采用CRISPR编辑方法，在细胞中同时破坏了猪细胞基因组中的62个PERV(猪内源逆转录病毒)序列，这些位点对用猪进行人体器官移植具有潜在的危害[6]。该技术的成功为用猪做人体器官移植的异源供体扫清了一个障碍，大大节省了进行多个基因编辑时的时间和人工成本，提高了CRISPR/Cas系统的工作效率。

除了基因编辑，CRISPR/Cas系统还可以应用于基因转录调控、RNA编辑、单核苷酸的改变(SNP)研究等，大大促进了CRISPR/Cas的应用范围。

基因转录水平的调控就是使基因表达增强或降低。科学工作者使Cas9失去核酸酶活性dCas9，但可以识别和结合sgRNA。在gRNA的引导下，dCas9与基因结合，不切割DNA，但却能阻止RNA聚合酶的转录，抑制基因表达。或者，在dCas9上连接转录激活蛋白如VP64，当识别并结合gRNA后，就会促进RNA聚合酶与基因的结合与转录，增强基因表达[4]。

Cas9可以作为RNA编辑的工具。参照sgRNA-Cas9的基因组编辑，科学家设计了1个较短的DNA双链，作为sgRNA结合的辅助物，而sgRNA的目标序列与目标RNA相匹配。同时把sgRNA、DNA短链和Cas9引入细胞，Cas9就可以在sgRNA引导下，切割单链RNA。O’Connell等用这种方法，在Hela细胞中进行了GAPDH mRNA的剪切[27]。Shmakov等把发现的53个CRISPR-Cas蛋白分为3组，分别是C2c1、C2c2和C2c3[28]。其中，C2c2很独特，其目标不是双链DNA，而是单链RNA，可以用于基因敲降。有研究利用纤毛菌(Leptotrichiashahii)的C2c2(LshC2c2)，在细菌中进行报告基因RFP mRNA的敲降，证实了C2c2的RNA编辑能力和基因表达调控能力[29]。C2c2还含有另一个RNase活性，可以产生成熟的crRNAs。C2c2可以从一个单一的转录本里面，产生多个crRNAs，进行RNA的编辑。那么，利用C2c2就可以进行高通量的基因转录水平的筛选和功能研究。

利用CRISPR技术，还可以进行单核苷酸的编辑。细胞中存在一些核苷脱氨酶，如胞苷脱氨酶等。胞苷脱氨酶包括活化诱导脱氨酶(AID，海鳗PmCDA1)、载脂蛋白B mRNA编辑酶(APOBEC)等，可以使胞嘧啶(C)脱氨成为尿嘧啶(U)，尿嘧啶在细胞DNA修复时就会变成胸腺嘧啶(T)；这样基因序列就从C：G变为T：A[30-33]。作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADARs)使腺苷(A)脱氨成为肌酐(I)，肌酐类似于鸟苷(G)与胞苷(C)配对；经过1次基因组复制，就会使DNA序列从A：T变为G：C[34]。Nishida等把失去核酸酶活性的Cas9与PmCDA1重组成融合蛋白，在sgRNA的引导下，使距离PAM 18个碱基位置上下的碱基发生了C到T的点突变[32]。Komor等重组了APOBEC1-dCas9，在人和小鼠细胞中实现了非结构改变的C>T点突变[31]。Yang等把脱氨酶与转录激活样效应子(TALE)或者锌指蛋白(ZF)重组，同样在人细胞或大肠杆菌中实现了C到T的点突变，人细胞中的突变率为2.5%；但是，他们发现在靶位点的上游150 bp有脱靶的脱氨作用，甚至于在全基因组发现了内源性的C、T突变[33]。基因组中存在许多的SNP，不同的SNP具有不同的基因活性，甚至与遗传病都有联系。那么，利用这些脱氨酶与Cas蛋白的结合，就能够促进SNP的研究，进而促进遗传病等的研究。但是，脱靶效应却大大阻碍了该技术的应用。因此，需要进一步研究该技术，使其只能在目标位点发生定点突变，而不是全基因组的改变。

在科学工作者的努力下，CRISPR技术功能不断被挖掘，其应用也不断扩大。CRISPR技术甚至已经应用于人类胚胎和人体基因的编辑[35-37]。Liang等进行了人类3原核受精卵的基因编辑，CRISPR/Cas9有效编辑了人内源的β球蛋白基因(HBB)，但同源重组修复效率比较低，脱靶效应明显[35]。美国食品药品监督管理局(FDA)批准了一个人体基因编辑的研究计划[36]。该计划希望能够用CRISPR来编辑人体的免疫细胞T细胞，将基因修饰后的T细胞灌注回病人体内，进而来治疗人类癌症、骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤。2017年，美、韩、中科学家合作，对人iPS细胞和人类胚胎进行了MYBPC3基因修正工作[37]。CRISPR/Cas9方法在合子中的修正效率达到72%[37]。该报道未见明显的脱靶效应，但是依然存在NHEJ现象，该研究对脱靶效应的分析也不是很全面、彻底。如果CRISPR/Cas技术完全克服了未知的脱靶效应，对于人类遗传病的治疗当然是非常好的。但是，脱靶效应使得该技术不能应用于临床，因为不可预期的脱靶效应可能会引起其他基因的改变，从而产生未能控制的效果，那就是解决了一个基因的问题而引起了其他基因的改变。从伦理学上来讲，现在大家还没有形成一个共识，许多人还不支持对人类胚胎进行基因的改变。虽然对人类遗传病的根治看见了曙光，但是由于伦理原因和脱靶效应等技术原因，目前还不能进入临床应用研究。人们可以期待在该技术成熟以及伦理共识达成以后，对人类生活的改变和疾病的治疗。

2 NgAgo技术

一个新的基因编辑工具，DNA介导的NgAgo曾被发表[38]。目前，该论文已经被撤稿[39]，但由于其引起的轰动效应，有必要在这里进行介绍，使人们进一步思考基因编辑工具的挖掘以及科研工作。正如撤稿声明中所说的，“发表论文不是研究工作的结束，而是研究工作的开始”。NgAgo是一种耐热古细菌Natronobacteriumgregoryi的Argonaute(Ago)蛋白的简称。Makarova等报导了原核生物的Ago同源蛋白可以作为细菌防御外来入侵的基因工具[40]。原核Ago具有核酸酶活性，可以在RNA或DNA的引导下，切割外来的基因或质粒。Olovnikov等发现球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)的Ago(RsAgo)在RNA引导下，可以干扰质粒DNA[41]。Swarts等发现嗜热栖热菌[ThermusthermophilusAgo(TtAgo)]可以在5′磷酸化的单链DNA(ssDNA，称为干涉DNA-siDNA)的引导下，切割单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)[42]；Swarts等还发现嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus的Ago(PfAgo)也只可以在siDNA的引导下，切割ssDNA和dsDNA[43]。但是，TtAgo和PfAgo只能在高温下工作，TtAgo切割ssDNA的温度≥20 ℃，切割质粒DNA的温度≥65 ℃。除特殊的耐热细菌等生物外，一般的生物细胞的生理温度都比较低，人细胞的生理温度为37 ℃。因此，TtAgo和PfAgo不能应用于一般生物细胞的基因编辑，不能成为广泛使用的基因编辑工具。

论文中报道NgAgo可以在37 ℃下的培养细胞中表达；NgAgo可以与24个碱基的5′磷酸化的单链DNA(gDNA)结合，并在其引导下切割基因组双链DNA，引起插入或切除等突变[38]。研究还宣称，NgAgo-gDNA系统不需要PAM序列，允许引导-目标的碱基错配，并且对高(G+C)含量的基因组序列都可以高效编辑，是一个新的基因编辑工具[38]。如果像该文所报道的那样，NgAgo就可以完全取代CRISPR/Cas9技术，成为理想的基因编辑工具，使人们自由编辑任意基因片段。因此，该文引起了轰动和广泛关注。

全世界科学家争相进行重复研究，但许多实验室宣告失败，无法重复该结果。随后，该文引起质疑与讨论。不同的科学家团队先后在Protein and Cells[44]、Nature Biotechnology[45]和Plos One[46]发表论文，认为NgAgo在哺乳动物细胞中不能进行DNA编辑，认为此研究不可重复。

Qi等在斑马鱼中进行了试验[47]。他们把体外合成的NgAgo mRNA与针对目标基因fabp11a的gDNA一起注射受精卵，结果引起斑马鱼眼睛不能正常发育。但是，fabp11a的基因组序列并没有任何改变，而是fabp11a的mRNA水平下降，即NgAgo-gDNA干扰了基因的表达。他们还进行了其他几个基因如ta、kdrl、lama1和flt1的试验，结果都能引起基因表达的下降。这些结果说明，NgAgo不能进行基因组编辑，但可能是一个很方便的基因敲降工具。Sunghyeok等研究证明，NgAgo和其他原核生物Ago蛋白不同，不能切割DNA但能切割RNA[48]。NgAgo能在DNA引导下，作为核酸内切酶切割RNA。NgAgo的向导DNA可以是5′羟基化的或5′磷酸化的寡脱氧核糖核苷酸片段(ODNs)。Sunghyeok等的研究解决了NgAgo进行基因敲降的机制问题，也解释了其他学者能够重复细胞中GFP表达量的减少而观察不到基因插入或切除现象的问题。

因此，NgAgo-gDNA可以作为基因敲降工具进行使用。那么，对NgAgo的研究就结束了吗？可能未必，也许对NgAgo、TtAgo和PfAgo的改进可以使Ago蛋白真能实现在普通生物中的基因编辑功能，但这需要一个艰苦的探索过程和一段较长的时间。该报道也提示科学工作者利用自然资源，进行基因编辑工具的进一步挖掘，向自然学习，进而改造自然。

3 其他基因编辑技术

除了Ago蛋白外，众多科学家都在寻找新的基因编辑工具。Xu等开创性地把翘尾核酸内切酶1(flap endonuclease-1，FEN-1)与TALEN中使用的Fok I的切割结构域(Fn 1)结合成为重组核酸内切酶[49]。FEN-1可以识别末端不匹配的翘尾结构，Fn 1可以对DNA进行切割，他们称这个重组酶为结构引导的核酸内切酶(structure-guided endonuclease，SGN)。SGN需要一个向导DNA(gDNA)与目标DNA配对，但其3′末端不与目标DNA配对，形成翘尾结构。SGN可以识别gDNA的翘尾结构，并由二聚体化的Fn1对DNA双链进行切割，因此SGN及gDNA需要成对使用。SGN对gDNA尾部碱基没有要求，但需要20个碱基以上，才能在离翘尾9～10个碱基左右的位点进行切割。体内试验表明，SGN的靶标DNA需要一个32～50 bp的间隔区。Xu等用SGN对斑马鱼znf703和cyp26b1进行了编辑，其效率为1%(znf703)～10%(cyp26b1)，但却移除了znf703基因的754 bp和下游的 11 bp，移除了cyp26b1基因的2 610 bp[49]。可见，SGN的编辑效率较CRISPR/Cas9低，且编辑去除的序列长度不受控制。工具是要能够被控制的，不受控制的基因序列切除使其不能成为可靠信赖的基因编辑工具。因此，该技术还需要进一步的研究和完善，发现其工作过程中的机制及可控制性。在该技术可控以后，才能成为新的广泛使用的基因编辑工具。

Zheng等报导利用ADAR对基因组进行编辑的技术[34]。人有2个ADAR，分别是ADAR1和ADAR2。ADAR蛋白含一个双链RNA结合结构域(dsRBDs)和C端的脱氨酶结构域。ADAR可以在RNA二聚体时，将A转变为I。Zheng等发现ADAR在DNA/RNA杂合体时，可以使DNA的dA脱氨成为dI，从而实现dA到dG的转变[34]。他们用ADAR1和ADAR2都实现了DNA/RNA杂合体中DNA的突变，然后，成功实现了24 nt gRNAs引导下的M13噬菌体单链DNA的突变。今后，有可能使用ADAR的脱氨酶结构域或者全序列作为基因编辑工具，在真核细胞中实现gRNA引导下的dA到dG的定点突变。

Bentin等发现了肽核酸(peptide nucleic acid，简称PNA)，可以侵入双链DNA[50]。近几年科研者也相继发现了肽核酸可以作为基因编辑工具，Komiyama等发明了一个人工限制性DNA剪刀(artificial restriction DNA cutter，简称ARCUT)[51]。ARCUT是化学合成的伪互补(pseudo-complementary)PNA(pcPNA)和Ce(IV)/EDTA复合物，可以引起DNA双链断裂(DSB)。Bahal等用纳米颗粒把g替代的尾夹(g-substituted tail-clamp)PNA(gtcPNA)输送到培养的细胞或小鼠中，引起了基因编辑[52]。

Suzuki等发现5′末端突出的复合物DNA(TD)可以引起目标基因的改变，他们把一个已切开或没有切开的质粒和针对质粒靶标的TD，采用脂质体转染试剂共同转入Hela细胞，结果发现目的位置发生了改变，质粒的切割增加了7倍的序列转变效率[53]。这表明后期如果引入TD的同时引入核酸酶，可以增强基因编辑的效率。该研究为基因编辑技术的改进提供了一个新的思路。

4 基因编辑技术的展望

基因编辑技术使得人们可以针对性地改变生物细胞的基因，从而改变细胞中该基因的表达。基因编辑技术有广阔的应用前景，可以应用于基因功能研究、发育生物学研究、动植物甚至于微生物的基因改造及分子育种、基因治疗、癌症治疗等多个方面[54]。因此，基因编辑技术的研究成为了一个热点生物学问题。世界各国科学家争相进行新基因编辑工具的寻找或改造，以期获得编辑效率高、特异性强、不脱靶、易用性好、序列要求低的基因编辑工具。随着科学工作者的不断努力，新的基因编辑工具和编辑手段将不断涌现。科学家终将获得理想的基因编辑工具。在这个不断进步的过程当中，科学家要向自然学习，从微生物到高等生物的蛋白质库中寻找合适的工具蛋白；科学家也可以对找到的这些工具蛋白进行改造，包括突变、组合等多种途径；不同学科、不同国度的科学家也要通力合作，开发新的工具或辅助工具。让我们期待理想基因编辑工具到来的那一天。