与番茄颈腐根腐病抗病基因Frl连锁的标记及应用

刘 蕾， 王 辉， 李文丽， 王 富

(青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109)

番茄颈腐根腐病(Fusariumcrown and root rot，简称FCRR)于1974年首次在日本被发现[1]，之后于1976年在美国南部被发现[2]。目前此病害已对美国、日本、加拿大、墨西哥、以色列、韩国以及欧洲等许多国家和地区的番茄生产造成重大损失[3-7]。最近几年，该病在我国华北、东北地区发病较重，其中山东省最早于2010年在寿光市发现该病，随后逐渐蔓延至全省各地。当前，此病害已经严重威胁到山东省温室大棚冬春季番茄生产[8]。

引发番茄颈腐根腐病的病原菌主要是尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型(Fusariumoxysporumf. sp.radicis-lycopersici，简称FORL)，此病侵染周期相对较长，番茄一旦感染，目前还没有十分安全有效的治疗方法[9]，所以对于该病害最科学的防治方法就是选育抗番茄颈腐根腐病的新品种。已有研究结果表明，番茄颈腐根腐病抗病性遗传是由显性单基因Frl控制的[10]，并且3份抗源材料中的抗病基因均为同一种基因[11]，3份番茄颈腐根腐病抗源材料都是源自野生番茄Solanumperuvianum(PI126944、PI128650和PI126926)，已有研究者将其中的抗病基因转入栽培番茄中[12]，抗病基因Frl已被定位到9号染色体上[10，13]。

本研究利用与番茄颈腐根腐病抗病基因Frl连锁的分子标记SCAR200和C2-25在已知抗病和感病材料中进行验证[14-15]，进而在F1代抗病材料自交后代群体中进行分子标记辅助筛选，结合接种鉴定结果评价该标记的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用试验材料包括已知抗病材料P1、感病材料P2及其杂交1代，抗病F1代商品品种凯文及F2代群体材料共24株(分别编号为1～24)。

1.2 方法

1.2.1 番茄样品DNA的提取纯化及检测 采用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB)法提取试验材料的DNA并进行纯化，设计出合适的引物对番茄材料DNA进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳及成像技术显示DNA条带并观察分析。

1.2.2 引物合成 与番茄颈腐根腐病抗病基因Frl紧密连锁的共显性CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence，即酶切扩增多态性序列)标记C2-25由Staniaszek等设计[14]，SCAR200由Mutlu等设计[15]。引物序列交给生工生物工程(上海)股份有限公司协助合成。

1.2.3 PCR扩增反应 PCR反应体系：模板DNA(20～80 ng/μL)4.0 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 μL，引物F/R(10 μmol/L)各1.0 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.2 μL，dNTP(2.5 mmol/μL)2.5 μL，加ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s(SCAR200)或57 ℃退火40 s(C2-25)，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取PCR扩增产物约 10 μL，在2%琼脂糖凝胶电泳上检测PCR扩增结果，用自动凝胶成像系统观察照相，记录电泳结果。

1.2.4 酶切方法 使用限制性内切酶XapⅠ在37 ℃下将扩增产物酶切3 h，酶切反应体系：PCR产物5.0 μL、Buffer 1.5 μL、XapⅠ 0.3 μL，加ddH2O补足至15 μL。37 ℃酶切 2 h，取酶切产物5 μL经2%琼脂糖凝胶电泳检测，用自动凝胶成像系统观察照相，记录结果。

1.2.5 番茄抗病材料的接种鉴定 将病原菌进行摇菌培养，25 ℃、150 r/min振荡5 d，用3层纱布过滤除去菌丝并离心收集沉淀，将沉淀稀释成107个/mL，将生长至1张真叶期的番茄根洗净并将主根剪出伤口，浸泡在孢子悬浮液中15 min，并设置感病材料作为对照，置于18 ℃光照培养箱中培养，2周后观察发病症状。

2 结果与分析

2.1 SCAR200和C2-25在P1、P2、F1代及凯文中的验证

选用与番茄颈腐根腐病抗病基因Frl紧密连锁的分子标记SCAR200和C2-25，分别在抗病材料P1、感病材料P2、F1代及商品种凯文中进行PCR检测。由图1、图2可知，SCAR200在抗病材料P1中可扩增出290 bp左右的特异DNA条带，在感病材料 P2中可扩增出310 bp的目的条带， 在F1代和凯文中均可扩增出290、310 bp 2条特征谱带，可见SCAR200为共显性标记，可用于已知抗、感材料的分子标记辅助鉴定。

CAPS标记C2-25在抗病材料P1中的酶切产物存在700 bp 左右的特异DNA条带， 在感病材料P2中的酶切产物存在1 000 bp的目的条带，在F1代和凯文中均同时存在700、1 000 bp 2条特征谱带，可见该标记可以用于已知抗、感材料的分子标记辅助鉴定。

2.2 SCAR200和C2-25在凯文F2代群体单株中的检测

对与番茄颈腐根腐病抗病基因Frl紧密连锁的分子标记SCAR200和C2-25分别在凯文F2代群体中进行分子检测，由图3、图4可知，F2代群体24个单株中有7个单株(编号分别为1、13、15、17、19、20、21)在SCAR200和C2-25检测中为纯合抗病单株；有5个单株(编号分别为5、10、12、16、22)为感病单株；其余12个单株(编号分别为2、3、4、6、7、8、9、11、14、18、23、24)为杂合抗病单株。

2.3 凯文F2代群体抗病接种鉴定结果

对24份未知抗病性的番茄单株进行人工接种颈腐根腐病病原菌鉴定，由表1可知，6个单株(编号分别为5、10、12、16、22、24)表现为感病，主根和茎基部都出现萎缩变褐现象，并且株高较小，根的长度也明显短于未发病植株；其他植株根和茎基部均表现正常，表现为抗病。

图3、图4的分子标记检测结果显示，有5个单株(编号分别为5、10、12、16、22)为感病单株，与接种鉴定结果相比，仅有1个单株(编号为24)在分子鉴定过程中显示为抗病，而在接种鉴定结果中显示为感病，可见分子标记鉴定结果的准确率为95.83%。

3 结论与讨论

近年来有研究表明，分子标记SCAR200在纯合抗番茄颈腐根腐病材料中存在290 bp的特异谱带，在感病材料中存在310 bp的特异谱带，在杂合抗病材料中存在290、310 bp的条带；CAPS标记C2-25在纯合抗番茄颈腐根腐病材料中存在700 bp的特异谱带，在感病材料中存在1 000 bp的特异谱带，在杂合抗病材料中存在700、1 000 bp的条带[14-15]。

表1 凯文F2代群体抗病接种鉴定结果

注：R、S分别表示抗病、感病。

本研究利用与番茄颈腐根腐病抗病基因Frl紧密连锁的分子标记SCAR200和C2-25在已知抗病和感病材料中进行验证，进而结合接种鉴定方法在抗病商品种凯文F2代群体中加以应用。结果显示，SCAR200和C2-25均为共显性标记，可以用于已知抗病和感病材料中的分子标记辅助鉴定；SCAR200和C2-25在凯文F2代群体24个单株中均检测到7个纯合抗病单株、5个感病单株和12个杂合抗病单株；接种鉴定结果显示，有1个单株与分子鉴定结果存在出入，即分子标记辅助鉴定的准确率为95.83%。

本试验中有1个单株接种鉴定结果表现为感病，而分子标记检测结果为抗病，这种差异可能与2个分子标记与抗病基因Frl间尚存在一定的连锁距离有关，因此后续研究可开发与抗病基因Frl连锁关系更近乃至基因特异标记，从而提高分子标记鉴定的准确度。