30种半翅目昆虫线粒体COⅠ基因密码子偏好性聚类分析

张玉波，周中艳，王廷慧，邓 娟

(1.安顺学院农学院，贵州安顺 561000； 2.贵州省昆虫信息系统与资源开发利用重点实验室，贵州安顺 561000)

COⅠ基因包含丰富的遗传信息，既相对保守又能保证足够变异，可作为属种系统进化研究的良好标记，被认为是动物界中最适合的DNA条形码标准基因[1-2]，目前已被广泛应用于昆虫分子系统发育分析。密码子偏好性指在编码氨基酸合成蛋白时，往往优先使用某一种或几种密码子[3]，被优先选用的密码子称为最优密码子，这一现象广泛存在于绝大部分的生物类群中[4]。Lynn等研究认为，不同的物种对密码子的使用具有很强的特异性，在进化过程中相近的物种具有相似的密码子使用模式，说明物种的密码子使用特点在进化过程中具有保守性，这种变化直接反映在核苷酸的组成上[5]。宋乔乔等对17种动物进行研究得出，密码子偏好性与物种之间的亲缘关系有关，亲缘关系越近的差异越小[6]。张晓峰等对水稻和拟南芥NBS-LRR基因家族同义密码子使用偏好的研究得出，NBS-LRR基因家族的密码子使用偏好受物种自身的影响很大[7]。晁岳恩等对11种植物psbA基因进行密码子偏好性分析，认为密码子偏好性不能正确反映物种间的进化关系[8]。

头喙亚目(Auchenorrhyncha)属于昆虫纲(Insect)半翅目(Hemiptera)，活泼善跳，飞翔能力强，刺吸式口器，在吸取植物汁液后传染病毒，是重要的农林害虫。目前，该亚目的4个总科分类系统被昆虫分类学者广泛接受，即蜡蝉总科(Fulgoroidea)、蝉总科(Cicadoidea)、沫蝉总科(Cercopoidea)、叶蝉总科(Cicadelloidea)[包括角蝉科(Membracidae)及其近缘科]。近年来研究表明，蜡蝉总科、沫蝉总科、角蝉总科(包括传统的叶蝉总科)、蝉总科均为单系群[9]。Campbell等多位学者就头喙亚目是否为一单系群进行了研究，总体上认为蜡蝉次目与异翅亚目的亲缘关系较近或为姐妹群[10-12]，线粒体基因组数据的研究同样支持头喙亚目为并系，但也认为鞘喙亚目与蜡蝉次目为姐妹群关系[13-15]。

本研究基于半翅目(Hemiptera)30种昆虫线粒体COⅠ基因密码子偏好性，利用SPSS 19.0对其密码子偏好性进行系统聚类分析，探究头喙亚目中各类群之间的关系及密码子偏好性在该类群的系统发育分析中的可信度。

1 材料与方法

1.1 序列数据

从GenBank中选择线粒体全基因组测序完整的30种昆虫，其中头喙亚目下蜡蝉总科有9种昆虫、沫蝉总科有5种昆虫、叶蝉总科有10种昆虫、蝉总科有3种昆虫，鞘喙亚目(Coleorrhyncha)鞘喙蝽总科(Karabasiidae)有3种昆虫。获得其中COⅠ基因全长编码区序列(coding sequence，简称CDS)部分，全基因组登录号见表1。

1.2 试验方法

1.2.1COⅠ基因中G、C含量分析 采用CodonW 1.4.2对30种昆虫COⅠ基因序列密码子进行分析，统计分析基因密码子的碱基组成规律，测得鸟嘌呤和胞嘧啶总体(G+C)含量、密码子第3位碱基(A3、G3、C3、T3)组成、密码子第3位的 C+G 数量(GC3)等数据。

1.2.2 有效密码子数量(effective number of codons，简称ENC)及同义密码子使用度(relatively synonymous codon usage，简称RSCU)分析 参照Fuglsang的方法[16]，利用有效密码子数来衡量基因单个密码子使用频率的偏好程度，其值在 20～61之间，越接近20偏好性越强[17]。同义密码子相对使用度是指对于某一特定的密码子在编码对应氨基酸的同义密码子间的相对概率。采用同义密码子相对使用度作为衡量COⅠ基因密码子使用偏好性的指标，RSCU越高，表示该密码子的相对使用率越高，它去除了氨基酸组成对密码子使用的影响参考，直观地反映了密码子使用的偏好性[18]。

表1 线粒体全基因组序列登录号

1.2.3 RSCU聚类分析 参照刘汉梅等利用SPSS 19.0对30种半翅目昆虫线粒体COⅠ基因RSCU进行聚类分析[19-20]。

2 结果与分析

2.1 COⅠ基因的密码子偏好性

各种类COⅠ基因的有效密码子数及密码子第3位的碱基含量见表2。分析COⅠ基因的碱基组成发现，30种昆虫中G+C含量在28.1%～36.4%之间，A、T含量明显高于G、C。密码子也以A或T结尾较多，A、T含量分别在34.65%～72.68%、28.27%～57.23%之间。30种昆虫密码子第3位4种碱基T、C、A、G占比平均值分别为40.66%、13.96%、58.04%、5.97%。这与Clary等指出的昆虫线粒体基因组具有比较高的A、T碱基含量，密码子的第3位倾向于选择A或T的结果[21-22]相符。

30种昆虫COⅠ基因的ENC在30.95～48.53之间，平均值为37.25，总体上看本研究所选用的类群基因密码子具有较强的偏好性。沫蝉总科、蝉总科、叶蝉总、蜡蝉总科、鞘喙蝽总科等代表物种的ENC平均值分别为31.88、34.22、35.92、39.98、45.44。其中，相对古老的类群如蜡蝉总科、鞘喙蝽总科的ENC明显较高，说明其COⅠ基因密码子偏好性较弱，较为进化的类群如沫蝉总科(Cercopoidea)、蝉总科(Cicadoidea)的COⅠ基因密码子偏好性较强。梁爱萍通过对多位学者的研究总结提出，半翅目中亲缘关系为胸喙亚目+{蝉子亚目+[蜡蝉子亚目+(鞘喙亚目+异翅亚目)]}[9]；Wang等通过对头喙亚目线粒体全基因组的分析得出，头喙亚目内的亲缘关系为蜡蝉总科+[叶蝉总科+(沫蝉总科+蝉总科)][23-24]。通过前后对比发现，同一单系群中亲缘关系越近的类群其COⅠ基因有效密码子数量差别越小，且在进化中越古老的类群COⅠ基因密码子偏好性越弱，这可能与线粒体COⅠ基因具有较高的进化速率有一定的关系。

2.2 COⅠ基因CDS聚类分析

以每一条基因代表作为对象，将该基因的RSCU作为变量，根据基因中各密码子RSCU，利用SPSS 19.0进行聚类分析。

由图1可知，褐飞虱属(Nilaparvata)中3个物种及禾沫蝉属(Callitettix)中3个物种分别完美地聚在了一起，沫蝉总科5个、叶蝉总科10个、蝉总科3个物种均较好地聚在一起，说明基于COⅠ基因密码子偏好性的聚类分析可以在一定程度上反映物种之间的亲缘关系。蜡蝉总科中的斑衣蜡蝉(Lycormadelicatula)与八点广翅蜡蝉(Ricaniaspeculum)聚在了沫蝉总科里，蜡蝉总科内种类也聚成了2支，且聚类混乱。这些不正确的聚类估计与蜡蝉总科的COⅠ基因密码子偏好性较弱有一定的关系。鞘喙蝽总科2种昆虫同绝大部分的蜡蝉总科聚在了一起，这与Song等通过线粒体基因组数据对比支持鞘喙亚目与蜡蝉次目亲缘关系较近的结果[13-15]较为一致。

表2 COⅠ基因密码子偏好性及密码子第3位碱基的构成

注：3s表示密码子第3位碱基的构成。

3 讨论

通过以上研究发现，基于30种昆虫COⅠ基因密码子偏好性的聚类分析在一定程度上可以反映物种间的亲缘关系，但也有一定的局限性，如蜡蝉总科下的昆虫类群聚类结果较为混乱，可能在同一单系群中COⅠ基因密码子偏好性的聚类分析更适用于较为进化的类群。虽然本研究结果表明，同一单系群中越古老的类群其COⅠ基因密码子偏好性相对越弱，但考虑COⅠ基因的长度较小，选用的物种数量有限等问题，这一结果尚须要更多的数据来证实。研究中选用的2属6种昆虫极好地聚成了2个分支，而较高级分类阶元之间聚类稍显混乱，也显示出基于COⅠ基因的昆虫密码子偏好性聚类分析更适于低级阶元亲缘关系的研究，这可能与COⅠ基因的长度小、进化较快有一定的关系。