朱顶红褪绿环斑病毒云南君子兰分离物S序列的克隆及分析

吴保为，吴家琪，胡玉洁，贾志强，高 雪，刘雅婷

(云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201)

朱顶红褪绿环斑病毒(hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)，是2013年在中国云南省发现的番茄斑萎病毒属新种[1-2]。该病毒主要通过蓟马进行传播，能够系统侵染朱顶红、烟草、番茄、辣椒、蜘蛛兰等多种经济作物，引起植物出现坏死、褪绿、同心环纹等症状，危害严重[3]。HCRV为三分基因组，3段单链RNA序列从小到大分别为S RNA、M RNA、L RNA，其中S RNA序列含有2个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，其正向编码444 aa的非结构蛋白(NSs)，相关研究表明，tospoviruses编码的NSs蛋白可能在病毒复制、转录、抑制RNA沉默中起重要作用[4]。S RNA反向编码275 aa的核壳体蛋白(N)，核壳体蛋白是研究Tospovirus病毒时，普遍最先获得的病毒序列，其序列特异性极高[5]，因此，通常都是利用比对核壳体蛋白N基因的相似性来检测与鉴定Tospovirus的病毒[6]。

目前，针对HCRV的研究较少，NCBI等数据库中已经公布的HCRV S RNA全基因组序列仅有2个，而且其常见寄主主要集中在蜘蛛兰、番茄等植物上，本研究通过大量野外采样调查，发现了新的HCRV寄主——君子兰，通过对该病毒君子兰分离物的S RNA进行克隆，测序及序列分析，获得了1个完整的HCRV S RNA基因组序列，为进一步开展HCRV研究提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病毒样本于2016年7月11日采自云南省昆明市云南农业大学的君子兰叶片，保存至-80 ℃超低温冷冻冰箱中。

1.2 试剂

TransZol Plant试剂盒、pEASY-T1载体、T1感受态细胞、Fast Pfu酶、Buffer及dNTP、Taq酶、SuperMix酶购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收纯化试剂盒，购自北京百泰克生物技术有限公司；dATP、Marker购自北京天根生化科技有限公司；TSWV、INSV、IYSV、WSMoV&GBNV、GRSV&TCSV抗体，购自美国Agdia公司；HCRV、TZSV、CCSV、CaCV抗体，由笔者所在课题组制备；PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa公司；其他常规试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 方法

1.3.1 样本鉴定

1.3.1.1 ELISA检测 利用笔者所在课题组构建的ELISA血清学鉴定体系，使用了9种抗体对君子兰样本进行了鉴定。其中5种抗体(TSWV、INSV、IYSV、WSMoV&GBNV、GRSV&TCSV)使用的是双抗夹心法(DAS-ELISA)，另外4种抗体(HCRV、TZSV、CCSV、CaCV)使用的是间接法(ID-ELISA)。参照对应方法说明书操作。

1.3.1.2 RT-PCR检测 RNA提取：应用北京全式金公司的RNA提取试剂盒对君子兰样本进行RNA提取。RT-PCR：RT使用的TaKaRa公司的RT试剂盒，PCR使用的是北京全式金公司的SuperMix酶。利用6对特异性引物及1对通用引物J13/UHP(表1)进行PCR扩增。

1.3.2 RNA提取、RT-PCR 利用TransZol Plant多糖多酚RNA提取试剂盒提取君子兰样本的总RNA。

利用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit合成样本cDNA的第一条链。

表1 RT-PCR检测所用引物信息

病毒分离物的S RNA全序列的扩增引物HCRV-S(F：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAACAAATAATCATACAC-3′；R：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAAACATAAATTCTGAAC-3′)由笔者所在课题组利用Primer 5.05设计，并用oligo 7对设计的引物进行分析，引物序列送至铂尚生物技术有限公司进行合成。利用FastPfu高保真酶，以合成的cDNA第一条链为模板，利用引物HCRV-S进行PCR扩增。50 μL PCR反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，FastPfu 1 μL，buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32 μL。PCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min 30 s，40个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR反应完成后，取5 μL产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 产物胶回收纯化及加A反应 利用DNA胶回收试剂盒对上一步获得的目的条带进行切胶回收，从而得到纯化过的PCR产物，产物-20 ℃保存。利用dATP、buffer、Taq酶对纯化后的S RNA序列PCR产物进行加A反应。10 μL加A体系：PCR产物7 μL，Taq酶 1 μL，buffer 1 μL，dATP 1 μL。加A反应程序：72 ℃ 30 min。

1.3.4 病毒分离物S序列的克隆和转化 将纯化并加A后的PCR产物连接到pEASY-T1载体上，导入到T1感受态细胞中，通过蓝白斑筛选挑取白色单菌落，通过菌液PCR筛选出阳性重组子，将3个阳性重组子的菌液送至铂尚生物技术有限公司进行测序。

1.3.5 病毒分离物序列处理 利用MEGA软件对测序公司返回的序列进行人工处理，去掉序列2端的载体序列，去掉序列3′端的A，从而获得病毒分离物的S RNA全基因组序列。

1.3.6 病毒分离物S序列分析 利用Mega 6.06，DNAstar. Lasergene v7.1等序列分析软件，从序列特征、系统进化分析等方面，对获得的病毒分离物HCRV-CM S RNA全基因组序列进行分析。

2 结果与分析

2.1 HCRV-CM病毒分离物S序列RT-PCR扩增

以采集到的云南君子兰叶片为材料提取总RNA，RT获得cDNA，以其为模板，用设计的HCRV S全序列扩增引物扩增出大小约为2 749 bp的特异性条带(图1)。

2.2 HCRV-CM分离物S序列克隆转化

共挑取20个单菌落，利用T1载体通用引物M13 F/R，通过菌液PCR筛选阳性重组子。电泳结果显示，挑取的20个单菌落均为阳性重组子(图2)。

2.3 HCRV-CM分离物S RNA序列分析

2.3.1 序列特征 从NCBI数据库中下载首个公布的HCRV S RNA全序列HLS1-2 S RNA(GenBank登录号：JX833564.1)，利用DNAstar进行序列比对，本研究分离的HCRV-CM的S序列(GenBank登录号：KY484836)与其一致性为98.7%(表2)。

2.3.2 HCRV-CM系统进化分析 从NCBI数据库下载所有已公布的HCRV病毒的核壳体蛋白N基因序列，与本研究所获得的N基因序列保存在一起，通过Mega 6.06，利用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建基于S RNA序列编码的Np基因的系统进化树。从系统进化树可以看出，本研究获得的病毒分离物HCRV-CM的Np基因与分离自云南省的HCRV的Np基因序列聚为一支(图3)。

3 讨论

Tospovirus病毒扩增迅速，近年来，该属新增的病毒不断增多，寄主范围也不断加大，根据ICTV公布的信息，Tospovirus已经有11个确定种。云南省气候类型多样，植被资源丰富，为病毒提供了广泛的寄主条件。目前，云南已经报道了6种Tospovirus病毒，分别是番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，TSWV)[7]、凤仙花坏死斑病毒(impatiens necrotic spot virus，INSV)[8]、花生环斑病毒(groundnut ringspot virus，GRSV)[9]、 番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus，TZSV)[10]、马蹄莲褪绿斑病毒(calla lily chlorotic spot virus，CCSV)[11]、朱顶红褪绿环斑病毒(hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)。HCRV是2013年在云南省发现的Tospovirus新种，其寄主范围仅集中在几种常见的tospoviruses寄主中，仍有众多的植物寄主未被发现。本研究利用RT-PCR以及ELISA技术在云南农业大学校园内的君子兰上检测到该病毒，并克隆了该病毒分离物的S RNA全基因组序列，对其序列特征以及分类地位进行了分析，为后续进一步研究HCRV提供了基础。此外，研究HCRV寄主范围具有极其重要的意义，通过了解其寄主的扩张以及范围的增大，可以及时探究该病毒的危害。

表2 HCRV-CM与HLS1-2分离物核苷酸和氨基酸序列一致性比对

本研究获得的HCRV-CM分离物表明君子兰(Cliviaminiata)是Tospovirus新的寄主，HCRV-CM S RNA(GenBank登录号：KY484836)在序列结构上与全球首次公布的HCRV HLS1-2分离物的S RNA基本一致，其编码的2个蛋白NSs、Np，以及非编码区、IGR区，与HLS1-2 S RNA的一致性都在90%以上，仅3′UTR区域在碱基数目上相差较大，HCRV-CM的S RNA的3′UTR相比HCRV HLS1-2多了19个碱基。在对NCBI数据库中已公布的Np序列进行系统进化分析，发现本研究分离的HCRV-CM株系与来自云南省的HCRV分离物聚为一支，来自广东、广西和福建的HCRV株系聚为另一支，株系明显存在按照地理进行分布的迹象。