野葛钙离子依赖性核酸酶PlCaN基因克隆和生物信息学分析

郭坤元，林先明，何美军，郭汉玖

(湖北省农业科学院中药材研究所，湖北恩施 445000)

野葛[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]别称甘葛或者葛藤，是我国传统的大宗中药材，富含淀粉[1]及异黄酮类物质[2]，其中淀粉具有可食用性，异黄酮类物质具有降血压血脂[3]、抗氧化[4]、保护肝[5]等作用，具有良好的食用和药用价值。我国野生和人工栽培的葛类资源年总量比较丰富[6]，但是目前相关研究大多停留在育种和栽培等比较基础的层面上，有关野葛功能基因及调控机制的研究还比较少，因此，开展野葛功能基因及调控机制的研究迫在眉睫。

核酸酶是一种特异性作用于磷酸二酯键的酶，能够水解核酸链生成低聚核苷酸或者单核苷酸[7]，在遗传物质的重组[8]、碱基错配识别和切割异源DNA[9]等多个途径中起着重要的作用，同时核酸酶活性还依赖于如钙离子等各种各样的金属离子[10-12]。一些植物中的钙离子依赖性核酸酶已经被发现并报道，比如利用基因芯片技术在水稻中发现了1种OsNAC4编码的参与核DNA降解的钙离子依赖性核酸酶[13-14]；在小麦中发现了1种可以凋亡细胞并降解和碎裂细胞核DNA的钙离子依赖性核酸酶[15]；在拟南芥中发现了1种分子量为26 ku，对DNA和RNA均有降解能力的钙离子依赖性核酸酶[16]，但是到目前为止，在中药材中有关核酸酶基因及其功能机制方面的研究还未见报道。本研究以野葛为试验材料，采用逆转录PCR(RT-PCR)、 cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends，简称RACE)等方法克隆野葛钙离子依赖性核酸酶基因PlCaN的cDNA全长序列，并对其进行生物信息学分析和蛋白表达载体的构建，希望可以通过这些结果为后续该基因功能等方面的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野葛试验材料采自华中药用植物园试验基地，带回实验室后用液氮速冻并立即置于-80 ℃储藏备用。大肠杆菌菌株DH5α保存于湖北省农业科学院中药材研究所。

试剂主要包括RACE cDNA扩增试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]、总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant Kit[天根生化科技(北京)有限公司]、FastQuant RT Kit[天根生化科技(北京)有限公司]、pMD18-T载体试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]、DNA marker[天根生化科技(北京)有限公司]、PCR产物回收试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，其他生化试剂均为进口或者国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 野葛总RNA的提取与反转录 取采集的储藏于 -80 ℃ 的野葛材料，在液氮下研磨均匀后按照总RNA提取试剂盒说明书进行RNA提取。用1.2%琼脂糖凝胶电泳和荧光分光光度计检测提取的RNA浓度和质量。以提取的RNA为模板，按照FastQuant RT Kit说明书进行反转录试验。

1.2.2 引物设计 通过对GenBank上已经登录的拟南芥(Arabidopsisthaliana，登录号AY128927)、烟草(Nicotianasylvestris，登录号XM_009798421)、玉米(Zeamays，登录号NP_001147648)、谷子(Setariaitalic，登录号XM_004968244)、高粱(Sorghumbicolor，登录号XM_002457238)、大豆(Glycinemax，登录号NM_001255851)等植物的核酸酶氨基酸序列进行同源性比对，挑选出高度保守区段序列，设计引物P1和P2(表1)。

1.2.3PlCaN保守序列克隆 以反转录合成的cDNA为模板，扩增PlCaN保守区域片段。PCR反应体系为50 μL，包括2.0 μL模板cDNA、5 μL 10×PCR缓冲液、2.5 μL dNTP(10 mmol/L)、各1.0 μL上下游引物(20 μmol/L)、0.5 μL DNA聚合酶(5 U/mL)，用无菌去离子水补足至50 μL。反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。目的片段回收和纯化按照DNA胶回收试剂盒说明书进行。将纯化回收的DNA连接至克隆载体pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经氨苄固体培养基过夜培养后，随机挑取单克隆进行PCR验证，阳性克隆接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中培养过夜，由华大基因测序。

表1 引物名称和序列

1.2.4PlCaN的RACE扩增及全长cDNA序列的获得 按照TaKaRa 5′-Full RACE Kit和3′-Full RACE Kit说明书将野葛总RNA分别反转录成cDNA；按照TaKaRa 5′RACE和3′RACE试剂盒说明书以及已得到的核心片段序列，使用Primer Premier 5.0设计5′-RACE和3′-RACE反应所需的引物P3、P4、P5(表1)，分别对PlCaN的5′端和3′端进行PCR扩增，5′-RACE以5′-RACE-first-strand cDNA和Outer PCR产物为模板，3′-RACE以3′-RACE-first-strand cDNA为模板。PCR产物的回收、克隆与测序方法均同“1.2.3”节。将PlCaN的核心片段、5′端和3′端序列利用软件进行拼接，获得该基因的全长cDNA序列。根据拼接得到的全长序列，分别在5′端和3′端设计特异性引物P6、P7(表1)，进行PCR扩增得到目的基因，PCR产物的回收、克隆与测序方法均同“1.2.3”节。

1.2.5PlCaN序列的生物信息学分析 将获得的PlCaN编码的氨基酸序列在GenBank数据库中进行Blast比对分析，利用DNAMAN软件对已发表的其他植物的CaN编码的氨基酸序列进行同源性分析，并通过MEGA6.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树。通过在线网站分析，预测相对分子质量及等电点(http：//web.expasy.org/protparam/)，进行疏水性(http：//web.expasy.org/protscale/)，利用TMHMM预测跨膜结构域(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、信号肽(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、亚细胞定位(http：//psort.hgc.jp/form.html)、蛋白质的二级结构(ExPASy在线)，利用SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)进行结构域的三维同源建模。

1.2.6 pBRT7-PlCaN表达载体的构建 根据目的基因PlCaN的核苷酸序列设计引物P8和P9(表1)扩增PlCaN的cDNA全长。回收PCR产物并将回收产物克隆到pMD18-T载体上，然后测序。对测序正确的pMD18-T-PlCaN质粒和原核表达载体pBRT7分别进行双酶切，回收酶切产物，用T4连接酶于16 ℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌，挑取阳性单菌落进行PCR鉴定。

2 结果与分析

2.1 野葛总RNA的提取与检测

如图1所示，2次提取的RNA电泳条带清晰，说明叶片总RNA提取结果较好，同时D260 nm/D280 nm平均值为1.98，说明提取的总RNA纯度比较高，适用于后期cDNA的制备和PCR扩增。

2.2 PlCaN全长cDNA的克隆

以野葛cDNA为模板，用引物P1、P2扩增得到1条约 850 bp 的PCR产物(图2泳道1)，扩增产物长度符合引物设计。通过在美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information，简称NCBI)数据库中的比对分析，发现该序列与其他植物的CaN核酸序列相似度较高，因此推测该序列为PlCaN基因的保守区片段。根据设计的RACE引物P3、P4、P5进行PCR扩增，获得CaN的5′端980 bp(图2泳道2)和3′端630 bp(图2泳道3)，经纯化回收后连接到pMD18-T载体上，转化DH5α，选取阳性克隆进行测序。用DNAMAN对5′-RACE和3′-RACE所得序列和保守区序列进行拼接得到cDNA全长电子拼接序列，以其为模板设计引物扩增CaN基因全长cDNA序列，结果显示扩增产物的长度为1 000 bp左右(图2泳道4)，并进一步对其进行载体连接测序验证，得到长度为 1 008 bp 的片段，将该片段再次在NCBI的数据库中进行Blast分析，进一步验证所得基因序列为PlCaN的cDNA序列。

2.3 PlCaN生物信息学分析

利用在线网站(http：//web.expasy.org/ protparam/)预测PlCaN蛋白相对分子质量为37.3 ku，等电点为9.4，化学式为C1 669H2 629N477O479S8，共5 262个原子数。蛋白亲/疏水性预测结果显示，在第105个氨基酸位置疏水性最大，峰值为 1.895，在第322个氨基酸位置亲水性最小，谷值为-3.225，整个分布区域亲水性氨基酸区域多于疏水性氨基酸区域，可认为PlCaN为亲水性蛋白(图3-A)。TMHMM跨膜结构分析表明，PlCaN蛋白没有跨膜结构域。亚细胞定位分析表明，PlCaN蛋白定位于细胞质的概率约为0.450，定位于微体的概率约为0.363，定位于其他细胞器的概率较低。SignalP 4.1 Server分析结果显示，C值为0.270，Y值为0.202，S值为 0.265，得分均较低，表明PlCaN蛋白无信号肽(图3-B)。

利用PredictProtein等在线分析软件对PlCaN的二级结构进行预测，结果显示该蛋白的二级结构由约49%的α-螺旋、19%的β-折叠和32%的不规则卷曲组成，其中α-螺旋和不规则卷曲占的比例较高。在NCBI的蛋白质数据库中对PlCaN的氨基酸序列进行同源性比对，结果发现其与高粱(序列登录号为XP_002457283.1)的同源性最高，为88.0%。在PlCaN整个氨基酸序列中，丙氨酸(Ala)的含量最高，超过了11%，半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)的含量最低，不到 1.5%(图4-A)，另外蛋白质三级结构预测显示它是由3个α-螺旋组成中心结构，另外含有1个β片层和部分不规则卷曲(图4-B)，这也与二级结构的预测结果相吻合。

由图5可知，氨基酸同源性比对显示，PlCaN与拟南芥、玉米、谷子、高粱、大豆、烟草等植物的序列相似性较高，平均相似率达到86.5%。

利用MEGA软件对PlCaN进行系统进化分析，选取12种与其同源性较高的植物构建系统进化树，由图6可知，PlCaN与高粱、水稻(Oryzasativa)的亲缘关系最近，与芜菁(Brassicarapa)、烟草、樟子松(Pinussylvestris)等物种的亲缘关系较远。

2.4 pBRT7-PlCaN表达载体鉴定

对构建好的pBRT7-PlCaN表达载体进行PCR鉴定，由图7可知，PlCaN的长度为1 000 bp，可见扩增片段大小正确，表明蛋白表达载体pBRT7-PlCaN构建成功，可以进行后续的融合蛋白诱导等试验。

3 讨论与结论

野葛是豆科的一种藤本植物，既具有药用价值又具有食用价值，淀粉和葛根黄酮是其主要的功能药效成分。本研究利用RT-PCR技术从葛根中克隆了1种钙离子依赖性的核酸酶，其全长为1 008 bp，编码335个氨基酸，序列比对结果表明PlCaN与谷子、高粱等有很高的同源性，为Ca2+依赖型，参与降解核酸底物等生理功能[10]；预测PlCaN蛋白相对分子质量为37.3 ku，等电点为9.4，是没有跨膜结构域、不含信号肽分子的亲水性蛋白，亚细胞定位，它最有可能定位于细胞质；蛋白质二维和三维结构显示其α-螺旋和不规则卷曲所占比例较高；进化树分析表明PlCaN与高粱、水稻的亲缘关系最近，与芜菁、烟草、樟子松等物种的亲缘关系较远。本研究还构建了pBRT7-PlCaN重组质粒，并进一步鉴定该重组质粒构建成功。总之，本研究为下一步利用实时定量PCR技术分析野葛PlCaN基因时空表达特性以及PlCaN蛋白诱导表达、纯化和酶活特性研究奠定了基础。另外，将克隆得到的基因转化到模式植物拟南芥中进一步研究其功能特征也将是今后的研究方向。