高坡猪PRKAA1基因多态性对肉质性状的影响

易恒洁， 李 辉， 赵忠海， 杨华婷， 石 璇， 王成栋，3

(1.贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州省正安县畜牧产业发展办公室，贵州遵义 563400； 3.贵州省毕节市农业产业办公室，贵州毕节 551700)

单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)具有感受细胞能量代谢变化的功能，其α亚基存在磷酸激酶活性调控区，参与某些糖的磷酸化过程，能够调节机体细胞单糖、挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)等供能物质的代谢过程[1-3]。在真核细胞动物中，AMPK家族基因包含了不同的亚基基因，它包括PRKAA1、PRKAA2、PRKB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2和PRKAG3等7个基因。Lee等研究表明，AMPK信号通路的基因已被证实能够改变细胞的代谢并在恶性肿瘤发生过程中起着重要的作用[4]，因此，PRKAA1基因可作为大肠癌患者手术切除后的预后标志。Yuan等研究显示，PRKAA1基因在免疫调节和炎症反应方面发挥关键作用，人的该基因多态性可能使其更易感染慢性乙型肝炎病毒[5]。研究表明，PRKAA1基因属于编码蛋白基因，能够在骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞中表达。孙成娟等报道，PRKAA1基因在贵州香猪肺脏纤维细胞中的表达量极显著高于其他细胞，而在背最长肌中的表达量最低[6]。Kim等对477例韩国人群PRKAA1基因5个异突变位点进行假设分析，结果发现PRKAA1基因的单核苷酸多态性(SNP)与患胃癌风险呈正相关[7]。目前，对于PRKAA1基因的研究主要集中于人类疾病以及一些模式生物上，对于畜禽的研究报道较为鲜见，高坡猪是贵州优良地方品种，具有肉品质好、抗逆性强、耐粗饲等特点[8]，但由于近年来外来品种的引进，加之农户采用粗放型饲养方式养殖，人为因素过强地干预选育，高坡猪品种资源岌岌可危，本研究以高坡猪为研究对象，以期寻找有效的分子遗传标记，为该品种进一步的开发利用、保种等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验以高坡猪为研究对象，试验用动物由贵州自然之园生态农业发展股份有限公司高坡猪养殖场提供，随机抽取10月龄的50头高坡猪进行屠宰，采集背最长肌置于冰盒带回实验室，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 基因组DNA提取

试验采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，分别对50头高坡猪背最长肌中基因组DNA抽提，并用微量紫外分光光度计对所获得的DNA进行浓度和纯度测定，1.0%琼脂糖凝胶检测其完整性。

1.3 引物设计及PCR扩增

根据GenBank发布家猪PRKAA1基因序列，利用引物设计软件Primer 5.0对猪PRKAA1基因设计8对特异性引物进行全部外显子扩增，引物由上海英骏科技有限公司合成。PCR扩增反应采用30 μL体系，具体操作如下：上游引物 2 μL，下游引物2 μL，DNA模板3 μL，2×TaqPCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)14 μL，双蒸水9 μL；95 ℃预变性5 min，95 ℃变性40 s，退火35 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃终延伸10 min，32循环。基因扩增引物详细信息见表1。

1.4 肉质测定

参照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的测定》，用直接干燥法测定肌肉水分含量；参照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》，用微量凯氏定氮法测定粗蛋白质含量；参照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》，用索氏抽提法测定粗脂肪含量；参照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的测定》，用灼烧称质量法测定粗灰分含量。

表1 高坡猪PRKAA1基因扩增引物详细信息

1.5 数据处理

利用Excel 2007对数据进行分类统计，DNAstar进行序列分析、比对，调用SPSS 18.0中的GLM模型对不同基因型与肉质性状间的关联性进行相关分析，结果以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测

以高坡猪基因组DNA为模板，分别对8对引物进行PCR扩增，产物用1.2%琼脂糖凝胶检测，结果发现目的条带与预期结果一致，且引物特异性良好，PCR产物无需纯化可直接用于测序(图1)。

2.2 PCR产物测序及序列分析

根据目的片段扩增结果，将PCR产物全部送往北京诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序。测序结果经DNAstar拼接并与GenBank发布的猪PRKAA1基因序列进行校正、比对，结果在试验群体的PRKAA1基因中发现存在3个SNPs(图2)，分别为g.12988 T

2.3 高坡猪PRKAA1基因遗传特性分析

测序结果经序列对比发现，在试验群体的PRKAA1基因中找到了3个SNPs，根据3个SNPs对应的突变位置将它们分别对应的纯合子和杂合子命名为TT、TC，AA、AG、GG和AA、AG、GG基因型。根据表2统计的结果，g.12988 T0.05)；除了g.12988 T

表2 高坡猪PRKAA1基因多态位点基因型频率及等位基因频率

2.4 PRKAA1基因与肉质性状关联分析

根据SNPs分型的结果，对不同基因型与肉质间的关联性进行分析，由于g.12988 T

表3 PRKAA1基因多态位点与肉质性状关联分析

注：同行数据后标有不同小写、大写字母分别表示基因型差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)。

3 讨论与结论

对于养殖户或者育种家来说，在追求动物快速增长的同时更加注重肉品质的质量。目前从人们的消费习惯来看，消费者更加注重肉质的风味，而影响肉质风味的重要指标之一则是肌内脂肪的沉积程度。有研究结果表明，PRKAA1基因对肌内脂肪的沉积起到一定的调控作用[9]，与骨骼肌的形成和肌纤维的类型也有着密切的联系[10]。Zhong等研究结果表明，PRKKA1和PRKAA2基因可介导磷酸化乙酰辅酶A的活性，从而使机体适应高应激环境，当动物处于环境压力较高、体内酶活性降低的时候，PRKK1和PRKAA2基因可同时介导使胚胎干细胞分化增加，弥补干细胞的数量不足，以提高动物的繁殖能力[11]。Kim等认为，PRKAA1基因的5个SNPs位点与胃癌的发生相关[7]。目前，关于PRKKA1基因的相关研究报道较少，在猪上的研究更少，孙成娟等对贵州从江香猪PRKAA1基因mRNA表达在组织中的表达情况进行探究，结果发现在其试验所涉及的组织中均能检测到表达，说明该基因属于广谱表达基因[6]。田万强研究指出，PRKAA1基因第7外显子上的213T/A多态位点与秦川牛肌内脂肪含量极显著关联(P<0.01)[12]。本研究以高坡猪PRKAA1基因为研究对象，对该基因进行PCR扩增，序列对比发现在g.12988 T

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