大豆食心虫高毒力球孢白僵菌菌株的筛选

陶淑霞， 陆子慧

(吉林农业大学农学院，吉林长春 130118)

大豆食心虫(Leguminivoraglycinivorella)为单食性害虫，主要危害大豆，分布于我国东北、华北及山东等地，以东北三省危害严重，主要为幼虫蛀荚危害，常年蛀食率为10%～20%，严重时蛀食率为30%～40%，严重影响大豆的产量和品质[1]。初孵幼虫在豆荚上爬行数小时后，钻入豆荚进行危害，发育至老熟幼虫后脱荚，钻入土中越冬，大豆食心虫的整个世代只有很短时间是暴露在外的，因此防治非常困难。目前，主要是在成虫发生盛期以菊酯类药剂防治大豆食心虫[2-3]。

球孢白僵菌(Beauveiabassiana)是害虫微生物防治中一种重要的虫生真菌，可侵染15个目的昆虫和一些螨类，具有分布范围广、侵染力强、易于形成真菌流行病等特点，因此被认为是具有开发潜力的生防真菌[4-5]。球孢白僵菌不同菌株对目标害虫的毒力存在着显著差异[6-8]。

球孢白僵菌是大豆食心虫幼虫的寄生性病原真菌，自然寄生率为5%～10%，是造成大豆食心虫自然死亡的主要因素之一[9]。为提高球孢白僵菌对大豆食心虫老熟幼虫的防治效果，须要筛选对此虫具有高毒力的菌株。本研究采集自然球孢白僵菌菌株，并对其生物学性状、毒力等指标进行比较研究，旨在筛选出生物学性状优良，且对大豆食心虫老熟幼虫具有高毒力的菌株，以期为大豆食心虫的生防技术提供指导。

1　材料与方法

1.1　供试菌株及培养基

供试菌株分别采自吉林省长春市、黑龙江省哈尔滨市和牡丹江地区的大豆食心虫越冬幼虫，采集后进行分离与纯化。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，简称PDA；配方为200 g马铃薯，30 g葡萄糖，20 g琼脂，10 g酵母，1 000 mL 蒸馏水)。萨氏培养基(sabouraud dextrose agar with yeast extract，简称SDAY；配方为40 g葡萄糖，20 g琼脂，10 g酵母，10 g蛋白胨，1 000 mL蒸馏水)。萨氏液体培养基(sabouraud dextrose with yeast extract，简称SDY；配方为40 g葡萄糖，10 g酵母，10 g蛋白胨，1 000 mL蒸馏水)。供试菌株的寄主昆虫及采集地点如表1所示。

1.2　供试昆虫

在吉林农业大学大豆中心收集自然脱荚的大豆食心虫老熟幼虫，选取发育整齐一致的幼虫作为供试昆虫。

1.3　菌落生长性状观察

分别取各分离菌株平板上的孢子粉，配制浓度为1.0×107个/mL的孢子悬浮液。取5 μL孢子悬浮液接在含有PDA培养基的培养皿中，重复3次，于25 ℃条件下培养，观察并记录各菌株菌落的形态，在第14天时测量各菌株菌落的直径。

表1　供试菌株的寄主昆虫和采集地点

1.4　产孢量测定

在各菌株培养至第14天时，用打孔器(直径为10 mm)在菌落半径1/2处打孔取菌块，每个菌株重复3次，将菌块置于三角瓶中，加入20 mL 0.05%吐温-80溶液，充分搅拌得到孢子悬浮液，利用血球计数板对孢子悬浮液进行观察计数。

1.5　孢子萌发率测定

分别取各菌株平板培养的分生孢子适量，加入20 mL SDY培养基中，配制浓度为1.0×106个/mL的孢子悬浮液，在25 ℃，130 r/min条件下培养24 h后，吸取20 μL菌液滴在血球计数板上，置于显微镜下，观察并记录孢子的萌发情况，芽管长度大于或等于孢子直径的孢子视为萌发[10]。

1.6　胞外蛋白酶含量测定

平板由质量体积比为1.0%的明胶和质量体积比为 1.5% 的琼脂配成。各菌株分别配制成浓度为1×108个/mL孢子悬浮液，各取10 μL滴于平板中心，每个菌株重复3次，于25 ℃条件下培养4 d后，将15%的HgCl2溶液倒入平板。在垂直2个方向分别测量透明环直径和菌落直径，以两者比值作为胞外蛋白酶产酶量的指示值。

1.7　毒力测定

1.7.1菌土的制备选取生物学性状良好的3个菌株(Cc-2、Cc-3、Mdj-3)用于毒力测定。将3个菌株的孢子悬浮液均匀涂在SDAY培养皿中，于25 ℃条件下培养10 d，取 0.5 mg 孢子粉，加入50 mL 0.05%吐温-80溶液中，配制成孢子悬浮液，在显微镜下测定该孢子悬浮液的浓度，计算出1 g孢子粉所含的孢子数。称取孢子粉与灭菌土(过50目筛)充分混匀，配制成含孢子数为1.0×107个/g的菌土，备用。

1.7.2测定方法取灭过菌的土壤并将其配制成含水量为20%的土壤，盛于塑料杯(8 cm×12 cm)中，然后在表面均匀洒上配制的菌土(以未施用菌土为CK)，每杯接入20头供试昆虫，待幼虫入土后，置于温度为25 ℃条件下培养，每个菌株设3个重复，在接种后第4、6、8、10天进行调查，计算不同时间的死亡率、校正死亡率、侵染率和致死中时(median lethal time，简称LT50)。

1.8　数据分析

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验各菌株生物学性状及其对大豆食心虫毒力的差异显著性(P<0.05)，用回归分析的Probit分析供试菌株对大豆食心虫的致死中时(LT50)。

2　结果与分析

2.1　不同菌株菌落形态分析

在PDA培养基上不同菌株的菌落形态存在较大的差异。由表2可知，菌株Cc-2、Cc-3、Mdj-1、Mdj-3和Heb-1均属薄粉状菌落，孢子层厚且产孢早；菌株Cc-1属绒毛状菌落，即菌丝生长速度快，但产孢量少；菌株Mdj-2、Heb-2均属毡状菌落，产孢量介于薄粉状和绒毛状之间。

表2　各菌株在培养基上的形态特征

2.2　不同菌株生长速率、产孢量、孢子萌发率的比较分析

由表3可知，不同菌株的生长速度存在显著差异(F7，23=218.09，P<0.000 1)。菌株Cc-1营养生长最快，第14天时菌落直径达61.66 mm，其次是菌株Cc-3、Mdj-3、Cc-2，菌落直径分别为59.36、54.18、52.14 mm，菌株Heb-2营养生长最慢，第14天时菌落直径为28.36 mm。各菌株的产孢量差异显著(F7，23=40.77，P<0.000 1)。菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3的产孢量较大，分别为1.26×108、1.14×108、1.32×108个/mL，菌株Cc-1的产孢量最低，为0.27×108个/mL。各菌株的萌发率也存在显著差异(F7，23=11.03，P<0.000 1)，菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3的萌发率较高，分别为96.01%、93.74%、95.17%。

表3　各菌株菌落直径、产孢量及萌发率

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下表同。

2.3　不同菌株的胞外蛋白酶活性比较分析

由图1可知，培养96 h后各菌株胞外蛋白酶产生水平有显著差异(F7，23=15.13，P<0.000 1)。菌株Cc-2和 Mdj-3 产酶量较高，产酶水平分别为2.03、1.88，两者差异不显著；其次是菌株Cc-3，产酶水平为1.57，其他菌株的胞外蛋白酶产酶量较低。

2.4　不同菌株对大豆食心虫的毒力分析

在上述研究的基础上，决定选取生物学性状优良的菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3进行致病力测定。由表4可知，不同菌株之间对大豆食心虫的校正死亡率(F2，8=22.05，P=0.002)和侵染率(F2，8=38.71，P<0.000 1)有显著差异，其中菌株Cc-2对大豆食心虫毒力最强，施药后第10天校正死亡率高达92.55%，侵染率为90.00%，致死中时LT50为 6.54 d。

表4　不同菌株对大豆食心虫老熟幼虫的毒力分析

3　讨论

不同来源的球孢白僵菌具有明显的寄主专化性[11]。姚剑等通过测定球孢白僵菌对马尾松毛虫(Dendrolimuspunctatus)和淡色库蚊(Culexpipienspallens)的毒力，确定不能用球孢白僵菌对淡色库蚊的毒力测定来代替对马尾松毛虫的毒力测定，验证了其寄主专化性的存在[12]。可见，应用白僵菌防治害虫最重要的是筛选对靶标害虫致病力强的菌株。

刘玉军等筛选了对栎旋木柄天牛(Aphrodisiumsauteri)高致病力Bb202菌株，该菌株产孢能力强且孢子萌发速度快[6]。张海剑等通过测定不同球孢白僵菌菌株对二点委夜蛾(Athetislepigone)的毒力，筛选出毒力较强的Ed-41菌株，该菌株具有生长快、孢子萌发速率高、产孢量大等优良性状[7]。结果表明，对大豆食心虫高致病力的菌株具有良好的生物学性状，可见，球孢白僵菌的生物学指标与菌株的致病力具有明显的相关性。

虫生真菌的蛋白降解酶能够分解寄主昆虫体壁中的蛋白质，有利于真菌穿透寄主体壁形成侵染[13-14]。冯明光发现，不同球孢白僵菌菌株胞外蛋白酶的产生量与供试昆虫的死亡率呈显著正相关关系[15]。结果表明，对大豆食心虫致病力强的菌株，其胞外蛋白酶的产生水平也较高。本研究中筛选的Cc-2菌株具有营养生长快、孢子萌发率高、产孢能力强且对大豆食心虫具有高毒力的特点，可作为防治大豆食心虫的生防菌株。

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