红枫湖樱桃花粉超低温保存探究

宋常美， 文晓鹏， 李庆宏

(1.贵阳学院生物与环境工程学院，贵州贵阳 550003； 2.贵州大学农业生物工程重点实验室，贵州贵阳 550025；3.贵阳市农业试验中心，贵州贵阳 550003)

花粉保存是育种工作的核心内容，适宜的保存方式能延长花粉活力，利于进行异地授粉，克服花期不育等困难，进行杂交种子生产及保持单倍体基因，可有效地推动育种工作的开展，为资源创新提供有力保障。温度和湿度是影响花粉贮藏的重要因素。低温和干燥的环境下，代谢过程减弱且呼吸作用降低，能较长时间保持花粉活力，随贮藏时间的延长，花粉贮藏物质消耗过多，酶活性下降，水分过度缺乏，从而使活力下降[1-2]。低温保存可适当延长花粉寿命，但活力仍会下降，超低温可长时间保持花粉活力并避免病虫害引入，且便于资源交换[3-4]。目前，凤梨[5]、柑橘[6]、唐菖蒲[7]、椰子[8]、桃[9]和橄榄[10]等植物花粉均已成功保存。而有关樱桃，尤其是中国樱桃花粉超低温保存却未见报道。

贵州省是樱亚属植物起源中心之一[11]，种质资源丰富，具有遗传改良物质基础。近些年，该省大力发展果蔬产业，樱桃被列为精品水果得以大面积发展，并引种甜樱桃，为利用其耐储存的特点，望将地方资源与其进行杂交能创造耐储存、品质优良且适合在西南大面积栽种的品种。然而，甜樱桃的花期较地方樱桃晚1个月，因此进行地方樱桃花粉长期保存研究具有一定的意义。红枫湖樱桃(PrunuspseudocerasuL.‘Hongfenghu’)是贵阳市本土种质资源，果实较大，可作为育种材料，本试验期望通过建立其花粉长期保存体系，为中国樱桃花粉长期保存提供理论参考，最终服务于育种工作。

1　材料与方法

1.1　材料

2011年2月底从贵阳市乌当区摘取即将开放的红枫湖樱桃花，随后将花药用镊子夹落在硫酸纸上自然阴干1 d，随后连同花药一起进行干燥处理。

1.2　方法

1.2.1试验设计本试验设置了液氮(-196 ℃)、-80 ℃及-20 ℃ 3种温度保存樱桃花粉。液氮保存即超低温保存，将花粉置于含硅胶的干燥器中，常温和4 ℃下干燥0、3、6、9、12 h后收集于冻存管并迅速置入液氮，1 h后用流水解冻 10 min 进行萌发率检测。-80 ℃及-20 ℃保存时将花粉置于含硅胶的干燥器，4 ℃下处理0、3、6、9、12 h后收集于冻存管，用锡箔纸包裹后放入试管盒，盒子用锡箔纸包裹后再用2个塑料袋包裹，分置于-80 ℃及-20 ℃保存12个月，干燥 3 h 的花粉每月检测1次活力，其余保存6个月后检测1次。此外，将-80 ℃及-20 ℃下保存3月后花粉取出置于含硅胶的干燥器，室温下干燥0、3、6 h/周，连续处理4周，检测保存过程中干燥时间对花粉活力的影响。每个处理含3支冻存管，即3个重复。

1.2.2花粉活力检测花粉活力检测采用离体萌发法和坐果率检测。离体萌发法检测操作如下：取适量培养基(0.1 g/L 硼酸+10%蔗糖+0.5%琼脂)在载玻片上，待凝固后用医用棉签蘸少量花粉均匀抖落在上面，随后放入垫有湿滤纸的培养皿，用保鲜膜封皿后置于恒温培养箱中培养，培养温度为25±2 ℃，8 h后统计数据。所有处理均含3个重复，每个重复培养3个载玻片，每个载玻片选3个视野计数，每个视野花粉数多于50粒。坐果率检测时将-80 ℃及-20 ℃下保存12个月的花粉进行同株授粉，同时采用当年花粉为对照，授粉时将处于铃铛期或棉花期的花朵进行连被去雄，30 d后统计坐果率。

1.3　数据统计分析

数据均采用SPSS 17.0软件分析，萌发率=萌发花粉数/花粉总数×100%(花粉管长度超过花粉粒直径作为萌发标准)，坐果率=坐果数/授粉总数×100%。

2　结果与分析

2.1　干燥温度及时间对超低温保存的影响

干燥温度对花粉超低温保存的萌发率有明显影响(图1)。2种温度下干燥3 h的花粉萌发率明显高于未干燥的花粉，未干燥花粉萌发率仅63.55%，而干燥后的花粉可达到83%以上。室温下随干燥时间的延长萌发率逐渐下降，12 h降至最低(54.65%)，15 h略有回升(62.57%)。然而，4 ℃下干燥的花粉萌芽率在3 h后并未随时间延长而降低。因此，为避免花粉活力下降，室温干燥时间以约3 h为宜，4 ℃下的干燥时间没有明显影响。

2.2　干燥时间及保存温度的影响

将干燥不同时间的花粉在-20 ℃及-80 ℃下保存6个月后进行活力检测，发现干燥时间无明显影响，萌发率为85%～86%(图2)。从图3可以看出，保存温度也无明显影响，-20 ℃及-80 ℃下保存的花粉萌发率无明显差异，且保存10个月前几乎无变化，随后略有下降。保存1个月后检测的花粉活力约为86%，12个月后降至约84%。因此，考虑技术及成本，-20 ℃下适合樱桃花粉较长时间保存。

2.3　保存中干燥时间的影响

为避免花粉湿度高导致萌发率下降，因此设计在保存过程中对花粉抽出进行干燥0、3、6 h/周，但发现干燥反而引起萌发率下降(表1)。-20 ℃及-80 ℃下，花粉活力均随干燥时间的延长而下降。-20 ℃下，不干燥萌芽率可一直保持85%以上，但4周后，干燥3 h和6 h的萌发率分别为67.61%和52.06%。-80 ℃下，不干燥萌芽率亦可一直保持85%以上，4周后干燥3 h和6 h的萌发率分别为61.93%和52.52%。

表1　保存中干燥时间对花粉萌发率的影响

注：同列数据后相同字母表示经邓肯氏多重极差检验在0.05水平上差异不显著。表2同。

2.4　坐果率检测

-20 ℃及-80 ℃下保存1年后的花粉与CK无显著差异(表2、图4)，保存的花粉授粉坐果率均可达到80%左右，但三者数值以-80 ℃最高(87.17%)，其次为CK(84.75%)、-20℃(78.68%)。由此可见，-20 ℃及-80 ℃下保存1年后的花粉可用于授粉。

表2　保存温度对坐果率的影响

3　讨论

Towill认为超低温保存效果取决于花粉的干燥度，适宜的干燥方式和干燥时间对花粉储藏有较大影响[12]。许多植物用硅胶干燥4 h为好[13-15]。Barnabas认为含水量对花粉的超低温保存影响很大，但过分干燥不行[16-17]。干燥后的辣椒花粉进行超低温(-196 ℃)贮藏1年仍具有新鲜花粉一半活力，但未干燥几乎无有效储藏期[18]。本试验对干燥温度和时间进行了探讨，发现室温干燥3 h后可获得较高萌发率，干燥时间过长则萌发率下降，12 h后急剧下降。然而，本试验在-196 ℃、-20 ℃和-80 ℃下保存时均发现，4 ℃下干燥时间长短无影响，且试验中还发现部分花粉受潮成团的现象。本试验同时发现，将保存在-20 ℃和-80 ℃下的花粉取出，于室温干燥0、3、6 h后获得的结果不一样，干燥3 h或6 h花粉活力下降，尤其以6 h下降更快。这也许说明干燥时的温度对花粉保存的影响大于含水量。究其原因，可能有3点：一是花粉在4 ℃干燥时已经历低温锻炼，同时在放入-20 ℃和 -80 ℃ 时具有多层包裹物，一定程度上降低了低温的刺激，从而更利于适应环境变化。陶丽等在4 ℃、25 ℃及-80 ℃下储藏澳洲坚果花粉，发现-80 ℃最差，认为与保存前未干燥处理有关，这也说明干燥时的低温锻炼对花粉活力有一定影响[19]。二是室温干燥时温度较高，花粉失活较快。杨帆等采用自然干燥、干燥皿干燥、40 ℃烘箱干燥3种方式干燥澳洲坚果花粉，并在4 ℃保存，结果表明前2种方式下花粉萌发率极显著高于后者[20]。三是花粉经历反复的解冻和冷冻，细胞易受伤害导致活力下降。这与吕晋慧等在地被菊花粉保存上的观点[21]一致。综上，本试验认为，樱桃花粉干燥时的温度比含水量的影响更大，低温干燥可避免花粉活力在储存前快速下降。

花粉是否具有活力最有利的证据为是否能授粉，某些花粉经低温保存后，出现离体萌发率低而授粉能力强的现象[22]。这种现象可能是因为低温保存后的花粉对萌发培养基不敏感[23-24]，保存后的花粉萌发率达到10%～30%就能授粉坐果[25-26]。本试验中，储存于-20 ℃和-80 ℃下的花粉萌发率均在85%左右，授粉率与新鲜花粉相比无显著差异，甚至数值上-80 ℃储藏花粉高于新鲜花粉。矮牡丹经超低温保存后出现花粉萌发率明显升高的“冷刺激”现象[1]。魔芋[27]和山龙眼属[28]花粉超低温保存中均发现此现象，但该现象出现的机制目前尚不清楚。玫瑰花粉经液氮超低温保存后的授粉能力与新鲜花粉也没有区别[29]。Parton等将保存于-80 ℃下6个月的蜻蜓凤梨花粉进行授粉，授粉能力并未下降，而虎纹凤梨却被发现其授粉能力不如新鲜花粉[30]。飞燕草花粉储存在25 ℃下60 d便没有授粉能力，而-30 ℃下180 d后授粉能力高于新鲜花粉[31]。总体而言，-20 ℃便可进行樱桃花粉长期保存。

本试验储藏花粉是同花药一起保存的，与仅保存花粉的方法有差异，但也获得了较好的效果，这样使得操作更简便，且提高花粉利用率。这种方法在杜鹃红山茶花[32]和桂花[33]上亦用到。

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