3种麦类土传花叶病毒的多抗制备及检测应用

任春梅+程兆榜+朱慧+邰丽娟+陆凤霞+鲍传华+范永坚+周益军

摘要：采用PEG二次沉淀和蔗糖硫酸铯密度梯度离心，得到提纯的3种麦类土传花叶病毒（小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒）。透射电镜观察分别可见线状、直杆状病毒粒子，测定浓度分别达5.44、8.08、4.09mg/mL。提纯病毒免疫新西兰大白兔制备抗血清，得到的3株抗血清经酶联免疫吸附法测定效价分别达1∶12800、1∶25600、1∶6400。应用样品和多抗稀释的方阵试验，建立3种多抗的双抗夹心酶联免疫吸附法（TAS-ELISA），并对采自江苏省、安徽省、河南省、山东省的麦子病样进行检测，结果显示，阳性检出率较高，说明这3种病毒仍是我国麦子流行的主要病毒。

关键词：小麦黄花叶病毒；大麦黄花叶病毒；中国小麦花叶病毒；抗血清制备；血清学检测

中图分类号：S435.121.4+9文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0143-03

小麦黄花叶病毒（wheatyellowmosaicvirus，WYMV）、大麦黄花叶病毒（barleyyellowmosaicvirus，BaYMV）、中国小麦花叶病毒（Chinesewheatmosaicvirus，CWMV）是3种典型的麦类土传病毒，其引起的麦类土传病害严重影响麦子的产量及品质，三者均由土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxagraminis）传播，前两者属于大麦黄花叶病毒属（Bymovirus），CWMV属于真菌传杆状病毒属（Furovirus）[1]。WYMV主要分布于日本、韩国、中国[2]，BaYMV主要分布在日本、西北欧、中国，近年来在我国长江中下游及淮河地区发生较为严重[3-4]。分子生物学检测技术灵敏度高但操作繁琐且花费大，血清学方法操作简单且一次性可以处理大量样品而应用较为广泛，但其核心抗体价格比较昂贵且质量要求比较高。本研究以提纯的3种麦类土传病毒的病毒粒子为抗原，制备3种病毒的多克隆抗体，并以制备的抗体建立了3种病毒的TAS-ELISA方法，对田间样品进行了检测应用，旨在为此类病毒诊断、抗病品种选育等提供依据。

1材料与方法

1.1材料

WYMV、CWMV、BaYMV来自江苏省农业科学院试验病圃中有典型症状的小麦、大麦叶片，病圃原始病土分别来源于江苏省高邮市（WYMV）、江苏省盐城市（BaYMV）、江苏省大丰市（CWMV），病叶-20℃保存。RSV、RBSDV毒源由笔者所在实验室鉴定保存。试验用兔为饲养于江苏省农业科学院畜牧研究所兔场的新西兰大白兔。弗氏佐剂购于Sigma公司。碱性磷酸酯酶标记的第二抗体购于美国Agdia公司。超纯蔗糖、硫酸铯购于上海生工生物有限公司。BeckmanOptimaL-100XP超速离心机，其他生化试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1病毒的提纯

取小麦、大麦3种病毒病叶各400g，剪碎加3×抽提缓冲液，搅拌机搅碎，2层纱布过滤。加1/4滤液体积的CCl4，冰浴搅拌5min，静置10min，8000r/min离心15min。取上清，加6%PEG-6000、3%NaCl、1%TritonX-100，冰浴搅拌至全部溶解，4℃下放置6h或过夜。8000r/min离心20min，沉淀用悬浮缓冲液悬浮，10000r/min离心15min，取上清。上清加5mL30%蔗糖垫（含0.3%TritonX-100），25000r/min离心2h。沉淀用悬浮缓冲液悬浮，12000r/min离心10min，取上清。采用蔗糖硫酸铯不连续密度梯度离心法进一步纯化，22000r/min离心3h。离心管上端1/3处为病毒层，用样品缓冲液稀释，40000r/min离心1h。用0.5mL样品缓冲液悬浮沉淀，得到提纯病毒液，取20μL4℃保存，用于电镜检测；另取480μL-20℃保存。

1.2.2病毒的电镜观察及紫外检测

提纯病毒液经适当稀释，取1滴滴于Parafilm膜上，取有支持膜的铜网，膜向下置于液滴表面，放置数分钟，挟起铜网，从铜网边缘吸去余液，似干未干之时将膜向下置于2%磷钨酸液（PTA）滴上染色30s至2min，吸干余液，置于JEOLJEM-1200E-X电镜下观察病毒粒子形态。以pH值为7.2的0.01mol/LPB缓冲液为参照，用该缓冲液稀释病毒液再用紫外分光光度计测D260nm、D280nm值，计算病毒浓度、产量[5]。

1.2.3抗血清制备

于试验前1周到兔场选取体质量约2kg的健康新西兰大白兔公兔6只，每种病毒用2只，编号分别为W1和W2、Ba1和Ba2、C1和C2，于实验室饲养观察1周以度过应激反应期。兔免疫前取耳缘静脉2mL左右血液作为健康血清。免疫分6次进行，每隔1周注射1次，第1、第2、第3次采取大腿2点及背部皮下多点注射，注射所用病毒剂量为0.5mg；第3次注射结束10d后，取0.5mg病毒分别加强免疫，采用耳缘静脉注射，连续免疫3次，每次间隔1周。第1次注射用等体积完全佐剂充分乳化，后面5次用等体积不完全佐剂充分乳化。最后1次免疫10d后预采血进行效价测定，达到要求后进行大量采血。取血前1d晚上停止喂食，只少量饮水。采用心脏采血方式，每次取血完后将血浆放入灭菌培养皿中，室温下放置2h，移入4℃冰箱摆成斜面放置过夜。吸取血清，6000r/min离心10min，弃残余血球沉淀，上清即为抗血清[6]。

1.2.4抗血清效价测定

第6次免疫后第10天预采血2mL，采用TAS-ELISA法[7]测定抗血清效价。抗血清按1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800、1/25600、1/51200、1/102400、1/204800梯度进行稀释，同时取注射前的血清（本底血清）按同样的梯度进行稀释作为阴性对照，取包被液作为空白对照，试验组及对照组每个稀释度均做3个平行。

1.2.5抗血清特异性评价

对3种病毒的抗血清进行特异性评价。经鉴定单独感染RSV、RBSDV、WYMV、BaYMV、CWMV等5种病毒的病叶用0.05mol/L包被缓冲液（pH值为9.6）稀释20倍包被ELISA板，分别以3种病毒的免疫原作为阳性对照，健康叶汁为阴性对照，每处理重复3次，采用TAS-ELISA法测定3种抗血清的特异性。

1.2.6TAS-ELISA最适条件确定

采用方阵试验对3种病毒的抗血清进行TAS-ELISA最适条件测定。酶标板纵向从上而下，用pH值为9.6的碳酸缓冲液从1∶156.25至1∶20000倍比稀释3种多抗，酶标板横向从左至右用样品缓冲液以1∶10～1∶5120倍比稀释，酶标抗体稀释倍数为5000倍，分别以3种病毒为阳性对照（病毒稀释80倍，抗体同上倍比稀释），健康叶汁为阴性对照（叶片同上倍比稀释，抗体156.25倍稀释），每处理设3次重复，P/N>2.1作为阳性判断标准。基于“1.2.5”节中同属的WYMV与BaYMV抗血清有轻微的血清学交叉反应，作TAS-ELISA最适条件测定时，仅携带WYMV的样品同上倍比稀释，用BaYMV抗体同上倍比稀释进行检测，阳性及阴性对照设置同上，每处理设3个重复。仅携带BaYMV的样品用WYMV抗体采用同上处理方式进行检测，以寻找避开2种抗血清交叉反应的检测样品及各自抗血清最佳稀释倍数。

1.2.7抗血清的检测应用

利用3种病毒抗血清的TAS-ELISA方法对大麦、小麦样品进行检测，在江苏省高邮市、宝应市、仪征市、常州市、泰州市姜堰区、兴化市、盐城市盐都区、淮安市、大丰市，安徽省寿县及来安县，河南省遂平县，山东省临沂市、泰安市、济宁市等地的大麦、小麦中采集3种病毒疑似样品，用温室生长的大麦、小麦健康叶片作阴性对照，病圃中经检测为3种病毒的病叶为阳性对照，每处理设3个重复，以P/N>2.1作为阳性判断标准。

2结果与分析

2.13种提纯病毒的电镜观察及浓度检测

提纯的3种病毒经2%磷钨酸负染后在透射电镜下观察（图1），3种病毒经蔗糖硫酸铯不连续密度梯度离心后均有较纯且浓密的病毒粒子，同属的WYMV、BaYMV可见直线状或弯线状病毒粒子，粒子长度达200nm以上，WYMV粒子比BaYMV粒子长；CWMV为直杆状病毒粒子，粒子长度100～300nm，直径约为20nm。用紫外分光光度法测得提纯病毒浓度分别为5.44mg/mL（WYMV）、8.08mg/mL（BaYMV）、4.09mg/mL（CWMV）。

2.23种病毒抗血清效价的测定

分别获得2株抗血清，以间接ELISA法测定2株抗血清的效价。由图2可知，免疫前的本底血清在3种病毒免疫反应中都较弱，制备的3种抗血清分别在稀释12800倍（WYMV）、25600倍（BaYMV）、6400倍（CWMV）下仍有明显的血清学反应，表明三者的抗血清效价分别达1∶12800、1∶25600、1∶6400，3种抗血清均可用于后续免疫学试验。

2.33种病毒抗血清特异性评价

由表1可知，同属大麦黄花叶病毒属的WYMV与BaYMV有弱的血清学交叉反应，2种病毒的抗血清与CWMV、RSV、RBSDV反应均较弱。CWMV抗血清特异性较强，除自身病毒外，与其他4种病毒的反应均接近于健康植株的反应。

2.43种抗血清的TAS-ELISA方法建立

方阵试验结果表明，作包被的3种多抗血清倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，WYMV、BaYMV、CWMV多抗分别在1∶10000、1∶20000、1∶5000稀释度下，P/N值均大于2.1。3种病毒的样品稀释度为1∶10～1∶640时都较理想，当稀释度为1∶1280时，P/N值小于2.1，可以确定1∶640为检测极限稀释度。考虑到实际应用时检测灵敏度较高，初步确定3种病毒样品稀释度都选择1∶160，多抗稀释度分别选择1∶5000（WYMV）、1∶10000（BaYMV）、1∶2500（CWMV）作为TAS-ELISA的最适工作浓度。表2显示，BaYMV样品稀释80倍、WYMV多抗稀释5000～10000倍时，病样的吸光度约为健样的2倍，说明抗体稀释5000倍是临界值。表3显示，当WYMV样品稀释160倍时，BaYMV多抗稀释度为10000倍时是临界值。由此可知，WYMV、BaYMV样品适度为160倍，抗体稀释度分别选择1∶8000、1∶12000。

2.53种病毒抗血清的检测应用

应用3种抗血清的TAS-ELISA检测方法，对采自全国4个省16个县（市、区）的60个样品进行检测。由表4可知，WYMV分布最为广泛，除了在江苏省盐城市的大麦及淮安市、大丰市2地的小麦样品中均未检到外，其余县市均有分布，阳性检出率在20%以上。CWMV不仅在大丰市、淮安市2个老病区的样品上检测到，而且在兴化市的样品中也检测到，兴化市样品中有1株还存在WYMV与CWMV复合侵染的情况。盐城市的大麦样品上均为BaYMV，说明这3种病毒仍是麦类较为流行的病毒。大麦样品中均未检测到WYMV，小麦样品中也未检出BaYMV，说明应用笔者建立的TAS-ELISA检测方法可以有效避免2种抗血清的交叉反应。

3结论与讨论

WYMV、BaYMV、CWMV都是由禾谷多黏菌传播的。禾谷多黏菌是1种专性寄生于植物根部的低等真核生物，本身没有致病性，但是可以传播多种禾谷类作物病毒，引起禾谷类作物严重减产。此类病毒在病叶中的含量很低，较难提纯，主要原因是组织捣烂时病毒粒子容

易断裂，且提纯过程中病毒粒子容易聚集、不易悬浮、易丢失等。笔者选用PEG沉淀法，先用CCl4分离植物与病毒蛋白，用聚乙二醇沉淀病毒，悬浮液中加入0.1%巯基乙醇与0.3%TitonX-100，有效地解决病毒易聚集的问题。采用蔗糖硫酸铯不连续密度梯度法提纯病毒，克服了蔗糖密度梯度难以成带的问题，结果表明，采用此法提纯病毒时梯度离心后管中出现1条非常明显的病毒带，此带经进一步离心后得到浓度高且较纯的病毒，3种提纯

病毒紫外检测均呈典型核蛋白吸收曲线，透射电镜观察到类似的病毒粒子，检测浓度在4.09mg/mL以上。进一步使用3种提纯病毒免疫新西兰大白兔，制备了3种病毒的抗血清。经测定，制备的3种抗血清效价分别达1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特异性较强，同属的WYMV与BaYMV抗体存在较弱的血清学交叉反应，为了避免检测中出现假阳性问题，笔者对检测样品及抗体进行倍比稀释方阵试验，确定了能够避免交叉反应的稀释倍数，建立了3种抗体的TAS-ELISA检测方法，并对田间样品进行了应用检测。虽然之前已有这3种病毒相关抗体的报道[8-9]，但是制备抗体的毒源材料有差异，制备抗体的效价也不同。应用笔者建立的3种抗体的TAS-ELISA方法对田间样品检测结果显示，3种病毒在江苏省均有分布，特别是WYMV在江苏省7个县（市）均有分布，带毒率也较高，说明WYMV对江苏省小麦的危害仍然存在。

参考文献：

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[9]陈剑平，阮义理，董玛佳.大麦黄花叶病毒粒子的性质及抗体的制备[J].浙江农业科学，1988（5）：239-241，232.

病毒紫外检测均呈典型核蛋白吸收曲线，透射电镜观察到类似的病毒粒子，检测浓度在4.09mg/mL以上。进一步使用3种提纯病毒免疫新西兰大白兔，制备了3种病毒的抗血清。经测定，制备的3种抗血清效价分别达1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特异性较强，同属的WYMV与BaYMV抗体存在较弱的血清学交叉反应，为了避免检测中出现假阳性问题，笔者对检测样品及抗体进行倍比稀释方阵试验，确定了能够避免交叉反应的稀释倍数，建立了3种抗体的TAS-ELISA检测方法，并对田间样品进行了应用检测。虽然之前已有这3种病毒相关抗体的报道[8-9]，但是制备抗体的毒源材料有差异，制备抗体的效价也不同。应用笔者建立的3种抗体的TAS-ELISA方法对田间样品检测结果显示，3种病毒在江苏省均有分布，特别是WYMV在江苏省7个县（市）均有分布，带毒率也较高，说明WYMV对江苏省小麦的危害仍然存在。

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病毒紫外检测均呈典型核蛋白吸收曲线，透射电镜观察到类似的病毒粒子，检测浓度在4.09mg/mL以上。进一步使用3种提纯病毒免疫新西兰大白兔，制备了3种病毒的抗血清。经测定，制备的3种抗血清效价分别达1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特异性较强，同属的WYMV与BaYMV抗体存在较弱的血清学交叉反应，为了避免检测中出现假阳性问题，笔者对检测样品及抗体进行倍比稀释方阵试验，确定了能够避免交叉反应的稀释倍数，建立了3种抗体的TAS-ELISA检测方法，并对田间样品进行了应用检测。虽然之前已有这3种病毒相关抗体的报道[8-9]，但是制备抗体的毒源材料有差异，制备抗体的效价也不同。应用笔者建立的3种抗体的TAS-ELISA方法对田间样品检测结果显示，3种病毒在江苏省均有分布，特别是WYMV在江苏省7个县（市）均有分布，带毒率也较高，说明WYMV对江苏省小麦的危害仍然存在。

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