玉米抗病相关基因在玉米与玉米丝黑穗病菌、玉米黑粉病菌互作过程中的表达差异分析

邹晓威+王娜+刘芬+夏蕾+王艳丽+洪泽源+徐冲力+郑岩

摘要：提取玉米丝黑穗病与黑粉病发病叶片的RNA，反转录获得cDNA后，通过玉米抗病相关基因（登录号分别为：AI881638、AW424529、CF028241、CO526016、CK371597、BM379188、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111）的序列设计引物，对玉米抗病相关基因进行RT-PCR扩增，分析目标基因的表达差异。结果显示，抗病基因病程相关蛋白（BM379188）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酸（AW424529）、无毒性蛋白（AI881638）、富含亮氨酸重复区域蛋白激酶（CF028241）在2种病害发生过程中均呈现上调表达，其他选取基因在侵染玉米叶片中均未检测到其表达，所选取的抗病相关基因在对照玉米叶片中均未检测到其表达。

关键词：玉米；玉米丝黑穗病菌；玉米黑粉病菌；抗病基因；互作机制；基因表达

中图分类号：Q786；S435.131.4文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0150-03

玉米丝黑穗病（Sphacelothecareiliana）和玉米黑粉病（Ustilagomaydis）是2种经常发生的玉米真菌性病害，传统防治方法主要以种子包衣为主，但该方法会造成农民生产成本提高，并对环境产生不良影响，选育和推广抗病品种是控制玉米丝黑穗病与玉米黑粉病发生的有效措施[1]，因此有必要针对病原菌的侵染扩散机理对玉米抗病基因进行深入的研究。玉米丝黑穗病及玉米黑粉病的病原菌都属于黑粉菌科，其亲缘关系较近，在同一寄主上前者是系统性病害，后者是局部性病害。寄主植物在与病原菌互作的过程中，诱导表达的基因往往抑制或促进病原菌繁殖，这些基因的表达产物有直接攻击病原菌的病程相关蛋白，如病程相关蛋白、几丁质酶[2-4]；有参与调控的转录因子，如WRKY蛋白[5-6]；同时存在信号级联放大的蛋白激酶，如丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶等[7-9]。本研究根据前人研究结果[10]，选取部分玉米抗病相关基因，分析其在玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌侵染过程中的表达变化，为进一步明确寄主植物玉米与2种病原菌互作过程中的抑制或促进病菌繁殖的机制及抗病育种提供新思路。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验所用的玉米丝黑穗病菌SR1、SR2菌株及玉米黑粉病菌SG200菌株均为玉米与真菌互作实验室保存菌种。供试玉米品种为吉单209。

1.2试验方法

1.2.1接种菌液的制备从冻存管内取SR1、SR2菌株菌液至3mL的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeastextractpeptonedextrosemedium，YPD），以及SG200菌株菌液至3mL的YEPS培养基内，28℃振荡培养进行菌株活化，再分别从活化的菌液内取500μL菌液至100mLYPD、YEPS培养基内，28℃振荡培养12～16h，至菌液的D600nm值达到2.0。菌液离心后收集菌体，加适量灭菌纯水溶解，SR1、SR2菌液进行混合后与SG200菌株菌液置于常温下，用于下一步的接种试验。

1.2.2玉米植株的准备挑选玉米品种吉单209的饱满种子，用5%次氯酸钠溶液表面消毒3～5min后，用无菌水冲洗3次，28℃下放置在无菌水中侵泡5h；滤纸经过无菌纯水浸泡后平铺于无菌培养皿底部，将浸泡后的玉米种子转移到培养皿中的滤纸上，然后将培养皿放入光照培养箱内，在28℃条件下进行暗培养直至种子出芽；将出芽的种子播种于15cm塑料花盆中，每盆5粒。播种后的花盆放入光照培养箱内，在28℃条件下进行培养。

1.2.3玉米植株的病菌侵染种子出土的2张叶片完全展开时，使用“1.2.1”节方法制备的玉米丝黑穗病菌菌液对玉米植株进行注射接种；待种子出土的3张叶完全展开，进行玉米黑粉病菌注射接种；预留未接种玉米植株作为对照。注射接种玉米丝黑穗病菌2～3d后，玉米叶片会出现明显的褪绿病斑，取发病叶片于液氮中进行速冻后，置于-80℃冰箱中备用；注射接种玉米黑粉病菌3～5d后，玉米叶片出现明显肿瘤，切取肿瘤组织于液氮中进行速冻后，置于-80℃冰箱中备用。同时割取对照植株叶片于液氮中进行速冻，置于-80℃冰箱内备用。

1.2.4玉米发病叶片RNA提取分别取保存于-80℃冰箱内的发病叶片提取叶片组织中的RNA，操作方法如下：（1）收集1g发病玉米叶片在液氮中冷冻（冷冻后可放入-80℃冰箱长期保存）；（2）将叶片放入研钵中，加液氮后进行快速研磨2～3次，至叶片组织成粉末状；（3）收集粉末，放入30mL离心管中，加10mLTrizol后涡旋混匀；（4）室温下放置15min，再加入2mL氯仿，涡旋10s混匀；（5）室温下放置3min后，于4℃、3500r/min离心15min；（6）收集上清液转入到新离心管中，加入等体积的酚氯仿（苯酚和氯仿体积比为1∶1，pH值为8.0），涡旋10s混匀后，于4℃、3500r/min离心10min；（7）收集上清液转入新离心管中，加入5mL的异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min后，于4℃、9000r/min离心20min；（8）去除上清液后，加80μLRNAfreeH2O，放入-80℃冰箱保存待用。

1.2.5RNA反转录成cDNA首先用DNaseI、RNase-free酶消解RNA中的DNA，制备不含DNA的RNA。操作方法见使用说明书；然后选用全式金反转录试剂盒进行RNA反转录，形成cDNA；运用Nanodrop2000微量紫外分光光度计测定cDNA的浓度，将所有cDNA调至相同浓度。

1.2.6RT-PCR选取的抗病相关基因的登录号分别为AI881638、AW424529、CF028241、CO526016、CK371597、BM379188、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111、Actin（gi121211756）（表1），以基因登录号代表相关基因。根据抗病相关基因片段设计上下游引物（表2）。

分别以玉米丝黑穗病发病植株叶片组织中的cDNA、玉米黑粉病发病植株叶片肿瘤中的cDNA、未发病对照植株叶片组织中的cDNA为模板，对目标基因进行RT-PCR扩增。采用梯度PCR设置不同的退火温度，RT-PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min。内参对照为Actin基因。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抗病基因的信号强度。

2结果与分析

2.1RNA检测

样品总RNA检测结果表明，感染玉米丝黑穗病菌发病叶

片的RNA浓度为10525.3ng/μL，感染玉米黑粉病菌发病叶片的RNA浓度为9623.4ng/μL，纯度均较高。利用电泳检测RNA的完整性和质量，结果显示没有明显的拖尾现象（图1），说明提取的RNA质量较好，没有发生降解，可以用于后续试验。

2.2RT-PCR扩增检测

RT-PCR扩增结果显示，内参在对照植株叶片及发病植株叶片中均能正常表达，结果可信。所选取的抗病相关基因在对照植株叶片中均未见表达，玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌发病叶片中抗病相关基因AI881638、AW424529、CF028241、BM379188均呈上调表达。而选取的其他抗病相关基因CO526016、CK371597、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111在感染玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌发病叶片中均未见表达（图2）。

3结论与讨论

寄主植物与病原菌互作过程往往诱导许多基因的表达，其中包括转录调控因子、蛋白激酶及病程相关蛋白等[11]，这些基因的表达往往抑制或促进病原菌的繁殖。本研究结果显示，玉米感病品种吉单209在受到玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌侵染后，病程相关蛋白BM379188（PR1）、AI881638（avirulence-responsiveprotein）均上调表达，其中病程相关蛋白是植物防卫反应中的重要因子，在植物中广泛存在，PR1与无毒性病菌诱导蛋白在植物系统获得抗性中起到重要的作用，它们是植物受病原侵染或其他因子胁迫产生的诱导性蛋白，在抑制病原菌的繁殖过程中发挥作用[12-14]。基因CF028241、AW424529均上调表达，蛋白激酶通过氧化磷酸开启信号的级联放大作用，因此蛋白激酶结构的蛋白在2种病菌互作的过程中起到重要的作用；而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构在许多已经克隆的抗病蛋白中存在，可能在抑制2种病菌繁殖的过程中发挥作用[7-9]。本试验中选取的几丁质酶基因在接种与未接种玉米丝黑穗病病菌及黑粉病病菌的叶片中均未表达，说明该几丁质酶并未参与抑制2种病菌在玉米体内的繁殖。研究中未检测到WRKY蛋白的表达，说明WRKY蛋白并未参与促进2种病菌在玉米体内的繁殖。试验结果显示玉米与玉米丝黑穗菌及玉米黑粉菌的互作机制有相似之处，诱导表达的基因抑制或促进菌丝生长的机制相近。

参考文献：

[1]邢跃先，吴凤新，李姝睿，等.抗玉米丝黑穗病分子标记辅助育种研究[J].玉米科学，2012，20（6）：9-13.

[2]AgrawalGK，JwaNS，RakwalR.Anovelrice（OryzasativaL.）acidicPR1genehighlyresponsivetocut，phytohormones，andproteinphosphataseinhibitors[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2000，274（1）：157-165.

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[8]FeuilletC，SchachermayrG，KellerB.Molecularcloningofanewreceptor-likekinasegeneencodedattheLr10diseaseresistancelocusofwheat[J].ThePlantJournal，1997，11（1）：45-52.

[9]MartinGB，BrommonschenkelSH，ChunwongseJ，etal.Map-basedcloningofaproteinkinasegeneconferringdiseaseresistanceintomato[J].Science，1993，262（5138）：1432-1436.

[10]袁广胜.玉米抗穗粒腐病差异表达基因的分离及其功能分析[D].雅安：四川农业大学，2011：1-147.

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[12]NazR，BanoA，WilsonNL，etal.Pathogenesis-relatedproteinexpressionintheapoplastofwheatleavesprotectedagainstleafrustfollowingapplicationofplantextracts[J].Phytopathology，2014，104（9）：933-944.

[13]周益军，李硕，程兆榜，等.中国水稻条纹叶枯病研究进展[J].江苏农业学报，2012，28（5）：1007-1015.

[14]HwangIS，ChoiDS，KimNH，etal.Pathogenesis-relatedprotein4binteractswithleucine-richrepeatprotein1tosuppressPR4b-triggeredcelldeathanddefenseresponseinpepper[J].ThePlantJournal，2014，77（4）：521-533.

[15]GabrilsSH，VossenJH，EkengrenSK，etal.AnNB-LRRproteinrequiredforHRsignallingmediatedbybothextra-andintracellularresistanceproteins[J].ThePlantJournal，2007，50（1）：14-28.

分别以玉米丝黑穗病发病植株叶片组织中的cDNA、玉米黑粉病发病植株叶片肿瘤中的cDNA、未发病对照植株叶片组织中的cDNA为模板，对目标基因进行RT-PCR扩增。采用梯度PCR设置不同的退火温度，RT-PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min。内参对照为Actin基因。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抗病基因的信号强度。

2结果与分析

2.1RNA检测

样品总RNA检测结果表明，感染玉米丝黑穗病菌发病叶

片的RNA浓度为10525.3ng/μL，感染玉米黑粉病菌发病叶片的RNA浓度为9623.4ng/μL，纯度均较高。利用电泳检测RNA的完整性和质量，结果显示没有明显的拖尾现象（图1），说明提取的RNA质量较好，没有发生降解，可以用于后续试验。

2.2RT-PCR扩增检测

RT-PCR扩增结果显示，内参在对照植株叶片及发病植株叶片中均能正常表达，结果可信。所选取的抗病相关基因在对照植株叶片中均未见表达，玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌发病叶片中抗病相关基因AI881638、AW424529、CF028241、BM379188均呈上调表达。而选取的其他抗病相关基因CO526016、CK371597、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111在感染玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌发病叶片中均未见表达（图2）。

3结论与讨论

寄主植物与病原菌互作过程往往诱导许多基因的表达，其中包括转录调控因子、蛋白激酶及病程相关蛋白等[11]，这些基因的表达往往抑制或促进病原菌的繁殖。本研究结果显示，玉米感病品种吉单209在受到玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌侵染后，病程相关蛋白BM379188（PR1）、AI881638（avirulence-responsiveprotein）均上调表达，其中病程相关蛋白是植物防卫反应中的重要因子，在植物中广泛存在，PR1与无毒性病菌诱导蛋白在植物系统获得抗性中起到重要的作用，它们是植物受病原侵染或其他因子胁迫产生的诱导性蛋白，在抑制病原菌的繁殖过程中发挥作用[12-14]。基因CF028241、AW424529均上调表达，蛋白激酶通过氧化磷酸开启信号的级联放大作用，因此蛋白激酶结构的蛋白在2种病菌互作的过程中起到重要的作用；而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构在许多已经克隆的抗病蛋白中存在，可能在抑制2种病菌繁殖的过程中发挥作用[7-9]。本试验中选取的几丁质酶基因在接种与未接种玉米丝黑穗病病菌及黑粉病病菌的叶片中均未表达，说明该几丁质酶并未参与抑制2种病菌在玉米体内的繁殖。研究中未检测到WRKY蛋白的表达，说明WRKY蛋白并未参与促进2种病菌在玉米体内的繁殖。试验结果显示玉米与玉米丝黑穗菌及玉米黑粉菌的互作机制有相似之处，诱导表达的基因抑制或促进菌丝生长的机制相近。

参考文献：

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[15]GabrilsSH，VossenJH，EkengrenSK，etal.AnNB-LRRproteinrequiredforHRsignallingmediatedbybothextra-andintracellularresistanceproteins[J].ThePlantJournal，2007，50（1）：14-28.

分别以玉米丝黑穗病发病植株叶片组织中的cDNA、玉米黑粉病发病植株叶片肿瘤中的cDNA、未发病对照植株叶片组织中的cDNA为模板，对目标基因进行RT-PCR扩增。采用梯度PCR设置不同的退火温度，RT-PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min。内参对照为Actin基因。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抗病基因的信号强度。

2结果与分析

2.1RNA检测

样品总RNA检测结果表明，感染玉米丝黑穗病菌发病叶

片的RNA浓度为10525.3ng/μL，感染玉米黑粉病菌发病叶片的RNA浓度为9623.4ng/μL，纯度均较高。利用电泳检测RNA的完整性和质量，结果显示没有明显的拖尾现象（图1），说明提取的RNA质量较好，没有发生降解，可以用于后续试验。

2.2RT-PCR扩增检测

RT-PCR扩增结果显示，内参在对照植株叶片及发病植株叶片中均能正常表达，结果可信。所选取的抗病相关基因在对照植株叶片中均未见表达，玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌发病叶片中抗病相关基因AI881638、AW424529、CF028241、BM379188均呈上调表达。而选取的其他抗病相关基因CO526016、CK371597、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111在感染玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌发病叶片中均未见表达（图2）。

3结论与讨论

寄主植物与病原菌互作过程往往诱导许多基因的表达，其中包括转录调控因子、蛋白激酶及病程相关蛋白等[11]，这些基因的表达往往抑制或促进病原菌的繁殖。本研究结果显示，玉米感病品种吉单209在受到玉米丝黑穗病菌及玉米黑粉病菌侵染后，病程相关蛋白BM379188（PR1）、AI881638（avirulence-responsiveprotein）均上调表达，其中病程相关蛋白是植物防卫反应中的重要因子，在植物中广泛存在，PR1与无毒性病菌诱导蛋白在植物系统获得抗性中起到重要的作用，它们是植物受病原侵染或其他因子胁迫产生的诱导性蛋白，在抑制病原菌的繁殖过程中发挥作用[12-14]。基因CF028241、AW424529均上调表达，蛋白激酶通过氧化磷酸开启信号的级联放大作用，因此蛋白激酶结构的蛋白在2种病菌互作的过程中起到重要的作用；而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构在许多已经克隆的抗病蛋白中存在，可能在抑制2种病菌繁殖的过程中发挥作用[7-9]。本试验中选取的几丁质酶基因在接种与未接种玉米丝黑穗病病菌及黑粉病病菌的叶片中均未表达，说明该几丁质酶并未参与抑制2种病菌在玉米体内的繁殖。研究中未检测到WRKY蛋白的表达，说明WRKY蛋白并未参与促进2种病菌在玉米体内的繁殖。试验结果显示玉米与玉米丝黑穗菌及玉米黑粉菌的互作机制有相似之处，诱导表达的基因抑制或促进菌丝生长的机制相近。

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[5]WeiT，OuB，LiJB，etal.TranscriptionalprofilingofriceearlyresponsetoMagnaportheoryzaeidentifiedOsWRKYsasimportantregulatorsinriceblastresistance[J].PLoSOne，2013，8（3）：e59720.

[6]ChujoT，MiyamotoK，OgawaS，etal.OverexpressionofphosphomimicmutatedOsWRKY53leadstoenhancedblastresistancerice[J].PLoSOne，2014，9（6）：e98737.

[7]SongWY，WangGL，ChenLL，etal.Areceptorkinase-likeproteinencodedbythericediseaseresistancegene，Xa21[J].Science，1995，270（5243）：1804-1806.

[8]FeuilletC，SchachermayrG，KellerB.Molecularcloningofanewreceptor-likekinasegeneencodedattheLr10diseaseresistancelocusofwheat[J].ThePlantJournal，1997，11（1）：45-52.

[9]MartinGB，BrommonschenkelSH，ChunwongseJ，etal.Map-basedcloningofaproteinkinasegeneconferringdiseaseresistanceintomato[J].Science，1993，262（5138）：1432-1436.

[10]袁广胜.玉米抗穗粒腐病差异表达基因的分离及其功能分析[D].雅安：四川农业大学，2011：1-147.

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