干旱胁迫对金线兰POD活性及同工酶酶谱的影响

李光+龚宁

摘要：对生长一致的金线兰组培苗进行干旱胁迫试验，采用分光光度法和同工酶电泳技术分别研究了干旱胁迫期间金线兰POD活性及同工酶酶谱的变化。结果表明：干旱胁迫下，金线兰POD活性呈现“M”形的变化规律，同工酶条带数量发生改变，在胁迫的前2d，在“-”区产生4条新的酶带，表明在干旱胁迫下，金线兰试管苗迅速诱导POD新酶带以适应胁迫环境。胁迫3d，酶带条数减少到5条，与此同时POD活性也降到最低。从胁迫后4d起，在“+”区产生2条新的酶带。这可能是POD同工酶的表达基因有部分关闭或开启，导致酶带条数的增减。

关键词：干旱胁迫；金线兰；同工酶酶谱

中图分类号：Q945.78文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0208-02

干旱胁迫导致植物体内产生大量的活性氧，活性氧可以导致蛋白质、膜脂、DNA及其他细胞组分严重损伤[1-3]。在植物的抗氧化酶系统中，POD能将H2O2分解为无害的H2O和O2，降低细胞内活性氧的浓度，对维持植物正常的生理功能具有重要意义[4-6]。金线兰[Anoectochilusroxburghii（Wall.）Lindl]，别名花叶开唇兰，为兰科开唇兰属植物[7]，生活在阴湿环境中，干旱胁迫对金线兰的伤害较其他逆境严重。目前，金线兰组培快繁已经取得成功，已经进行工厂化生产，但是有关金线兰组培苗抗旱的研究鲜见报道，本试验对干旱胁迫下金线兰的POD活性和同工酶变化进行研究，为进一步了解干旱胁迫条件下金线兰的生理响应机制提供参考。

1材料与方法

1.1材料

材料为生长一致的金线兰组培苗，由贵州师范大学生命科学学院培养室提供。

1.2方法

取出金线兰组培苗，无菌水将幼根冲洗干净，放入MS营养液中适应性培养3d，再移入含不同浓度PEG6000的溶液中进行根际干旱胁迫处理。PEG6000的干旱胁迫设4个浓度处理：10%（处理Ⅰ）、20%（处理Ⅱ）、30%（处理Ⅲ）、40%（处理Ⅳ），每种处理重复3次。同工酶分析选择20%PEG6000处理的金线兰组培苗，培养温度为（23±2）℃，每天光照12h（08：00—20：00），光照强度为3000lx。

1.2.1粗酶液的制备准确称取成熟鲜叶0.50g，加入预冷的酶提取液（50mmol/LpH值7.8磷酸缓冲液内含0.1mmol/LEDTA，0.3%TritonX-100，4%PVP）5mL，冰浴充分研磨，于冷冻离心机（4℃）12000r/min离心20min，上清液即为粗酶液，冷藏备用。

1.2.2过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法[8]，3.0mL反应混合液（50.0mmol/L磷酸缓冲液500mL中含0.28mL愈创木酚和30%的H2O20.19mL）中加入50.0μL酶液，迅速摇匀，测D470nm。每30s读数1次，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，单位为U/（min·g）。

1.2.3电泳

1.2.3.1加样

浓缩胶聚合之后，小心拔出梳子，用滤纸条吸干梳孔中的水分，并注入预冷已稀释10倍的电极缓冲液。从冰箱冷冻室中取出样品，4℃下解冻，待样品解冻后，用微量进样器吸取80.0μL酶液，小心注入梳孔底部，同时记录样品号和相应的样品槽号，加入1滴0.1%的溴酚蓝指示剂。将电泳槽小心移入4℃冰箱中电泳。电泳条件：120min前电泳电压100B，120min后电泳电压200B，电泳时间22h。

1.2.3.2过氧化物同工酶染色

胶电泳完毕并经双蒸水冲洗3次后，在染液（0.1g联苯胺，5.0mL无水乙醇，10.0mL1.5mol/L乙酸钠，10.0mL1.5mol/L乙酸）中加入6～10滴30%的H2O2，迅速摇匀后倒在凝胶上，并将染色盒置于水平摇床上，室温下轻微摇动。待橙黄色酶带完全出现（约15min）后，倒出染色液，自来水冲洗，数码相机拍照后放入7%乙酸中保存。

2结果与分析

2.1干旱胁迫对金线兰组培苗叶片过氧化物酶（POD）的影响

由图1可知，干旱胁迫下不同处理叶片POD活性总体上呈现“M”形的变化规律，处理1在处理后2d，达到第1个峰值，达152.94U/（min·g），胁迫3～4d逐步降低，胁迫5～6d再次升高，到胁迫6d达第2个峰值。处理2、处理3、处理4的第1个峰值在胁迫3d出现。胁迫3～5d逐步降低，胁迫5d达最低，胁迫6d又迅速升高，达第2个峰值，胁迫7d再次下降。各处理第1次的峰值大于第2次的峰值，第1次峰值的大小顺序依次为：处理2[298.098U/（min·g）]>处理4[232.888U/（min·g）]>处理3[195.584U/（min·g）]>处理1[152.941U/（min·g）]。可见，金线兰对不同浓度的PEG6000干旱胁迫处理影响存在很大差异，其中20%的PEG6000处理，POD活性上升最高，因而选取这一浓度处理用于后续同工酶分析。

2.2组培苗过氧化物同工酶分析

组培苗POD同工酶电泳结果见图2。从图2可见过氧化物同工酶谱带共11条。随着干旱胁迫时间的延长，酶带表现一定的变化。胁迫1～2d，在“-”区产生4条新的酶带，表明在干旱胁迫下，金线兰试管苗迅速诱导POD新酶带产生以适应胁迫环境。胁迫3d，酶带条数减少到5条，与此同时POD活性也降到最低。胁迫4d起，在“+”区产生2条新的酶带，表明在干旱胁迫过程中，金线兰可能通过2种响应途径产生POD同工酶。

3结论

水分是植物的重要组成部分，是植物赖以生存的必要条件之一，无论是长期干旱还是短时间的水分亏缺都可能对植物的生长发育产生不同程度的影响。近年来，国内外学者对植物抗旱机理作了大量研究，取得了较好的研究成果，但是金线兰分布范围较窄，长期以来人们多关注于金线兰的药效研究，对于其抗旱性研究较少。周黎等以3种不同来源的金线兰组培苗（种子苗、根状茎苗、地上茎苗）为试验材料，研究金线兰组培苗渗透调节物质在土壤干旱胁迫下的变化规律[9]，但是他们仅仅研究了可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和游离脯氨酸受干旱胁迫后的变化情况，未提及POD在干逆胁迫条件下的变化情况。POD是重要的抗旱相关酶，对金线兰干旱胁迫下POD活性及同工酶带的变化进行研究具有重要的意义。

本研究结果表明，在持续干旱胁迫下，金线兰POD同工酶的电泳条带发生变化，即在干旱胁迫处理1～2d，金线兰POD同工酶的酶带数量逐渐增加，胁迫2d酶带数量达到最大。胁迫3d酶带数量急剧减少到最少，胁迫4～6d的酶带数量有所回升，这个变化与金线兰POD活性的变化基本一致。可能的原因是，在干旱胁迫的过程中，由于金线兰POD同工酶的部分酶带前体的活化，产生了新的酶带，这可能是在干旱胁迫下，金线兰POD酶带在胁迫1～2d有所增加的原因。随着胁迫时间的延长，酶发生了降解或部分降解，导致部分酶带消失或变浅，这可能就是干旱胁迫4dPOD同工酶酶带减少至最少的原因。而后3dPOD酶带有所增加，这可能是金线兰在受到较长时间的干旱胁迫后启动了新的POD的机制。由于POD较易失活，金线兰POD同工酶酶带的变化也可能完全是由相关基因的关闭和开启造成的，即在干旱胁迫的初期，金线兰迅速打开应急机制增加POD含量，随着胁迫的持续，金线兰增加POD含量的应急机制逐渐失效，导致胁迫3dPOD酶带减少至最少，胁迫5～7d金线兰POD酶带的增加，可能是由于金线兰启动了抵抗干旱胁迫的长效机制。然而金线兰在干旱胁迫条件下POD活性及酶带的变化究竟是由哪种机制调控的，需要进一步分子生物学的研究，以深入了解干旱胁迫下金线兰POD相关基因表达的变化情况。

参考文献：

[1]刘永辉.夏玉米不同生育期对水分胁迫的生理反应与适应[J].干旱区资源与环境，2013，27（2）：171-175.

[2]陈文佳，张楠，杭璐璐，等.干旱胁迫与复水过程中遮光对细叶小羽藓的生理生化影响[J].应用生态学报，2013，24（1）：57-62.

[3]张青，王进鑫，邹朋，等.水分和铅交互胁迫对国槐幼苗生理生化特性的影响[J].农业环境科学学报，2012，31（3）：476-483.

[4]王玉丽，焦培培，顾亚亚，等.胡杨叶形变化与POD同工酶的关系研究[J].干旱区资源与环境，2013，27（4）：181-186.

[5]程淑娟，唐东芹，刘群录.盐胁迫对两种忍冬属植物活性氧平衡的影响[J].南京林业大学学报：自然科学版，2013，37（1）：137-141.

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[8]金冬雁，黎孟枫.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，1992：55-56.

[9]周黎，龚宁，彭健.干旱胁迫下金线兰渗透调节物质的变化规律[J].贵州科学，2008，26（4）：68-71.

本研究结果表明，在持续干旱胁迫下，金线兰POD同工酶的电泳条带发生变化，即在干旱胁迫处理1～2d，金线兰POD同工酶的酶带数量逐渐增加，胁迫2d酶带数量达到最大。胁迫3d酶带数量急剧减少到最少，胁迫4～6d的酶带数量有所回升，这个变化与金线兰POD活性的变化基本一致。可能的原因是，在干旱胁迫的过程中，由于金线兰POD同工酶的部分酶带前体的活化，产生了新的酶带，这可能是在干旱胁迫下，金线兰POD酶带在胁迫1～2d有所增加的原因。随着胁迫时间的延长，酶发生了降解或部分降解，导致部分酶带消失或变浅，这可能就是干旱胁迫4dPOD同工酶酶带减少至最少的原因。而后3dPOD酶带有所增加，这可能是金线兰在受到较长时间的干旱胁迫后启动了新的POD的机制。由于POD较易失活，金线兰POD同工酶酶带的变化也可能完全是由相关基因的关闭和开启造成的，即在干旱胁迫的初期，金线兰迅速打开应急机制增加POD含量，随着胁迫的持续，金线兰增加POD含量的应急机制逐渐失效，导致胁迫3dPOD酶带减少至最少，胁迫5～7d金线兰POD酶带的增加，可能是由于金线兰启动了抵抗干旱胁迫的长效机制。然而金线兰在干旱胁迫条件下POD活性及酶带的变化究竟是由哪种机制调控的，需要进一步分子生物学的研究，以深入了解干旱胁迫下金线兰POD相关基因表达的变化情况。

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