昆虫对Bt毒素抗性研究进展

易晓莉　马晓　刘先方等

摘要：从Bt毒素杀虫机理、受体类型、昆虫对Bt毒素抗性机理及遗传特性等方面进行了综述，总结了近年来关于昆虫对Bt毒素抗性的研究进展情况，并对其研究前景进行了展望。

关键词：昆虫；Bt毒素；受体；抗性；遗传特性；研究进展

中图分类号：S482.3+9 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）07-0149-02

收稿日期：2013-10-18

基金项目：国家“863”计划（编号：2013AA102507）；江苏省六大人才高峰项目（编号：NY-025）。

作者简介：易晓莉（1989—），女，河南信阳人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：yixiaoli19892008@163.com。

通信作者：李木旺，博士，研究员。E-mail：muwang_li@hotmail.com。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种能产生伴孢晶体和芽孢的革兰氏阳性细菌，具有多个株系。由它产生的伴胞晶体对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫的幼虫具有特异的杀灭活性，所以这种伴胞晶体通常被称为Bt毒素或Bt毒蛋白，编码该蛋白的基因则被称为Bt基因[1]。但Bt毒素并不是对所有的生物都具有毒性，它仅对昆虫、线虫及其他特定的物种表现出特异的毒性，尤其对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫表现出极高的特异性[2]；且不同株系的Bt菌系产生的毒蛋白也具有不同的特异性[3]。

1Bt毒素杀虫机理

根据孢子形成方式的不同，Bt所产生的杀虫晶体内含物是由多种杀虫蛋白组成的，这些蛋白被称为Cry毒素或Cyt毒素。根据它们的氨基酸序列和基因序列将这些毒素分为67类，即Cry1～Cry67，它们对特定范围内的昆虫表现出高度特异的杀灭活性，所以作为可喷射杀虫剂的Bt产物具有一定的局限性，将Cry毒素引用到转基因植物中可为农业上的害虫防治提供一种更加高效特异的方法[4]。Bt所产生的蛋白主要包含2类杀虫活性成分，即杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）和营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal protein，VIP）[5]，后者不形成蛋白晶体，且两者在进化上无同源性。其中，ICP由于具有对目标昆虫特异的杀灭活性且对人及其他动物无害等特点，因此目前已被广泛用于农业害虫的控制，约占总体杀虫刹市场的2%。ICP的毒性并非来自本身，但当它被特定的昆虫取食以后，在昆虫中肠的碱性环境中逐步降解为有杀虫作用的活性肽，该活性肽与目标昆虫中肠刷状缘细胞膜泡（brush border membrane vesicle，BBMV）上的特异性受体相结合，引起细胞膜上孔洞的形成，致使细胞渗透平衡被破坏而发生渗透裂解[6]。同时，离子浓度梯度的改变也严重影响了中肠细胞内环境的稳定，从而阻碍昆虫对养分的吸收，最终导致昆虫停止取食而死亡。

2Bt毒素受体种类及作用

某一种杀虫剂可用于防治的各类害虫及使用范围称为杀虫谱。作为杀虫剂的Bt毒素也有其特定杀虫谱。毒素的杀虫谱在很大程度上是由昆虫中肠BBMV上的特异性受体决定的，毒素必须与受体结合才具备杀虫活性，因此昆虫体内特异性受体的种类是决定毒素杀虫特性的关键因子之一[7]。有研究证明，在目标昆虫体内主要有氨肽酶N（aminopeptidaseN，APN）、类钙黏蛋白（cadherin-likeprotein）、碱性磷酸酯酶（GPI-anchoredalkaline phosphatase）以及某种糖脂类（glycolipids）物质等4种Bt毒素受体[8]。其中，APN和类钙黏蛋白是昆虫体内与Bt密切相关的受体，所以对其研究也较为深入。APN是一种常见的蛋白酶，在动植物中分布广泛。APN上具有与Cry毒素特异结合的位点，目前已经确认某些鳞翅目昆虫中肠BBMV上的APN是Bt毒素的主要结合对象。Cry毒素与APN受体的特异性结合是决定Cry毒素杀虫活性的关键因素之一[9]。在家蚕（Bombyx mori）体内，BmAPN1上与Bt毒素结合的区域位于异亮氨酸（Ile）135 至脯氨酸（Pro）198之间，该序列包含63个氨基酸残基[10]。虽然所有的鳞翅目昆虫的中肠BBMV上都有丰富的APNs，但由APN所介导的Cry1A家族毒素的毒力大小在不同昆虫之前存在差异。

类钙黏蛋白是依赖钙离子的跨膜糖蛋白家族中的一员，在细胞增殖、分化以及细胞间的连接等生物过程中发挥重要作用。在昆虫中肠内，类钙黏蛋白与Cry毒素具有高度的亲和力，两者紧密结合会使中肠上皮细胞的结构和功能瓦解，最终导致昆虫死亡[11]。纯化得到烟草天蛾中肠BBMV上Cry1Ab毒素的受体Bt-R1，已被证明为一种类钙黏蛋白，能与Cry1Ab毒素高度特异性结合[12]。且Bt-R1与Cry1Aa及Cry1Ac的结合特征与Cry1Ab相似，说明Bt-R1可能对Cry1A毒素家族具有高度亲和力。

3昆虫对Bt毒素抗性形成机理

Bt杀虫晶体蛋白制剂及 Bt转基因作物已被广泛用于农业害虫的防治，一方面减少了化学杀虫剂的使用及其所产生的环境问题，另一方面也导致目标昆虫对其产生越来越强的抗性。据调查，已有多种昆虫群体在自然环境下对Bt蛋白制剂及Bt转基因作物产生了抗性；也可在实验室和温室中通过人工选择获得多种昆虫的抗性虫系[13]。这些抗性虫系对Bt毒素的抗性具有水平高、遗传稳定性好等特点，有的能够在Bt作物上完成整个生活史，说明抗性风险广泛存在于自然环境与人工环境中。

根据Bt毒素的杀虫机制，可推测昆虫对Bt毒素产生抗性的机理主要有Bt原毒素的溶解性及其水解能力、毒素与昆虫中肠细胞膜上受体结合情况的变化、细胞膜上孔洞的形成与疏通及中肠上皮细胞的自我修复功能等[14]。其中，毒素与昆虫中肠细胞膜上受体结合情况的变化是目前普遍认可的昆虫对Bt毒素产生抗性的最主要机理。受体结合情况的变化主要包括结合能力的变化和特异性位点数目的改变。经研究发现，烟芽夜蛾抗性虫系YHD对Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac产生抗性主要是由于这3种毒素在细胞膜上共同的结合受体发生改变，且这种抗性表现为隐性遗传方式。有研究表明，Cry1Ac对中肠上皮细胞的作用取决于细胞膜上是否具有APN，在成功构建了烟芽夜蛾的cDNA文库基础上，从YHD烟芽夜蛾中克隆了含有APN与Bt毒素特异结合的蛋白，称为Bt结合蛋白[15]。

进一步研究发现，烟芽夜蛾YHD2品系对Cry1Ac产生高水平抗性的主要原因是类钙黏蛋白发生了突变，编码区发生了反向转座子插入，导致该蛋白完全失活，使Bt毒素不能结合到中肠膜上[16]。因此，类钙黏蛋白改变也是昆虫对Bt产生抗性的主要原因之一。类钙黏蛋白和APN都是棉铃虫的Cry1Ac受体，它们的突变分别产生抗性虫系GYBT和Bt-R。在Bt毒素杀灭害虫过程中，类钙黏蛋白为毒素的第一受体，APN为其第二受体，它们分别在不同的过程中发挥作用，这2类受体的改变必然导致昆虫对Bt毒素产生一定的抗性。

4抗性形成的分子机制和遗传特性研究

昆虫对Bt毒素的抗性与晶体毒素的致毒机理密切相关，Bt毒素在杀虫过程中的任何一个步骤发生改变，都可能会导致昆虫产生抗性，因此体现出抗性机制的多样性。不同抗性机制所引起的抗性表现出各种遗传特性，如抗性水平的差异、不同的抗谱、显隐性和交叉抗性等。因此，有必要对抗性机制和遗传特性进行更加深入的研究。

Bt抗性的遗传方式随虫种和杀虫晶体蛋白类型不同而不同，但多为隐性遗传，只受少数基因位点控制[17]。烟芽夜蛾YHD2虫系是在室内经过人工筛选得到的，对CrylAc具有1万倍以上的抗性，且表现为隐性遗传。经过回交连锁分析，将该虫系的抗性主效基因定位在第9连锁群上2个分子标记之间，命名为BTR-4，是第1个被鉴定的Bt抗性基因。克隆发现的BTR-4是一个已发生突变的钙黏蛋白基因，在第5个钙黏蛋白的编码序列中插入了1个反转座子，导致该钙黏蛋白的编码提前终止，失去了与Cry1Ac结合的能力，从而使烟芽夜蛾对Cry1Ac毒素产生高度抗性[18]。随后，人们又从Bt转基因棉中筛选获得了7个Cry1Ac抗性虫系，有研究表明它们的抗性都是由钙黏蛋白基因的突变造成的[19]。

利用cDNA-AFLP方法分析了室内筛选的棉铃虫抗、感2种品系基因间的差异，发现抗性虫系体内的APN缺失了可与CrylAc结合的片段，导致毒素不能与受体结合而使昆虫对其产生抗性，说明棉铃虫抗性品系中APN基因的缺失突变与CrylAc的抗性相关[20]。最近鉴定出1个烟芽夜蛾抗性品系的抗性等位基因，该基因由1个编码ATP结合盒（ABC，ATP-binding cassette）转运蛋白分子的基因突变而来。这一基因的突变影响了Cry1A毒素与烟芽夜蛾中肠BBMV的结合，说明ABC转运蛋白分子可能作为一个新的Cry1A毒素受体，与低聚物和细胞膜的结合有关[21]。

以家蚕为研究对象，通过图位克隆鉴定出15号染色体上一个候选基因BGIBMGA007792-93，该基因以隐性方式控制家蚕对Cry1Ab的抗性。与上述烟芽夜蛾相似，该基因也编码一个ABC转运蛋白分子，且在家蚕中肠中表达[22]。

5昆虫对Bt毒素抗性研究前景

由于多种昆虫对毒素产生抗性的机理基本相似，在不同Bt毒素间容易产生交互抗性，且Bt品系和杀虫毒素间的交互抗性型也会随不同的抗性昆虫而有所不同[23]。虽然已对抗性的发生鉴定出多种潜在机理，但昆虫对Bt抗性的机理并无定论，分子生物学技术的发展有助于进一步研究不同昆虫对不同Bt毒素产生抗性的机制，从而进一步筛选、利用最高效的Bt毒素，发展多样化的Bt制剂及转Bt基因作物。

随着对Bt毒素受体等研究的深入，逐渐明确昆虫对Bt制剂或转Bt植物产生抗性的机制，以更好地持续利用Bt毒素这一珍贵的生物杀虫剂资源[24]。同时，陆续发现新的Bt毒素受体，这些新的受体基因的功能及其产生的突变与Bt抗性的关系成为未来昆虫对Bt毒素抗性机制研究的重点之一。这些研究为农林害虫的抗性监测和提出预防性的抗性治理策略提供了科学依据，这对我国Bt毒素制剂及转Bt植物的可持续应用具有重要意义。

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