马拉硫磷手性对映体在大鼠体内的代谢研究

吴艳　黄力彦　谭艳来等

摘要：用高效液相色谱法建立马拉硫磷手性农药对映异构体的拆分检测方法，以大鼠为研究对象，分为空白对照组（C）和试验组（T）。C组灌胃生理盐水2 mL/只，试验组灌胃马拉硫磷700 mg/kg后，分15、30、60、120 min分别采大鼠血浆、心脏、肝脏等样品，测定所有试验鼠血浆、组织中马拉硫磷对映体含量的变化情况，用EF（对映体分数）表示。通过口服途径对大鼠进行马拉硫磷对映体分析方法的建立及选择性代谢行为研究。结果表明，马拉硫磷对映体在大鼠血浆和组织中代谢存在明显的立体选择性，且R-构型较S-构型活性高。

关键词：马拉硫磷；大鼠；对映体分数

中图分类号： O657.7+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0306-03

收稿日期：2013-11-27

基金项目：广东省科技计划（编号：2011B040300015）。

作者简介：吴艳（1983—），女，安徽蚌埠人，硕士研究生，工程师，主要从事化学分析，色谱分析等方面的研究。E-mail：gyswuyan@163.com。有机磷手性农药被作为杀虫剂和杀菌剂广泛应用，对映异构体具有几乎完全相同的物理化学性质，但是其生物活性、毒性、代谢、残留等行为差别较大。但由于手性农药的特殊性，对映体选择性的转化及代谢行为还是人们比较陌生的领域，因此对映体的检测和代谢行为引起了人们广泛的关注。

马拉硫磷是目前广泛使用的手性农药，具有多种毒性效应，包括神经毒性、遗传毒性、免疫毒性和生殖毒性[1-2]等。目前对于马拉硫磷的水解，以及在土壤中的降解等行为已经研究得较为清楚，有关毒性、毒理方面的研究也已有很多报道。对于以高效液相色谱法建立马拉硫磷手性农药对映异构体的残留检测方法，通过测定血样及组织中对映体含量的变化情况，最终确定对映体的选择性代谢行为。本研究探讨了农药对人类健康潜在危害的成因，为合理使用农药、制定相关食品安全法规提供依据。

1材料与方法

1.1主要仪器和药剂

安捷伦-1100型高效液相色谱仪，配有四元泵；RE-52AA型旋转蒸发仪；马拉硫磷标准储备液浓度为100 mg/L，由农业部环境保护科研监测所提供。无水硫酸钠（分析纯），乙酸乙酯、乙腈（美国天地）、异丙醇及正己烷为色谱纯；用前过0.45 μm滤膜，去离子三蒸水。

1.2马拉硫磷手性拆分与定量

手性拆分由高效液相色谱仪完成，每次分离进样量 10 μL，手性色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为纤维素三苯甲酸酯（CDMPC，由本实验室自制）[3-4]，流动相为正己烷 ∶异丙醇=95 ∶5（体积比），流速0.8 mL/min，紫外检测波长254 nm，检测器进行定量分析。以保留时间定性，峰面积外标法定量[5-6]。柱温15 ℃，配制浓度为0.30、1.65、3.03、1510、30.30、151.00 μmol/L 的马拉硫磷标准溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得出标准曲线，根据标准曲线拟合计算出马拉硫磷对映体的浓度。采用峰高定量，高效液相色谱测试稀释的标准样品，以噪声的3倍计算出农药的最小检测灵敏度。

1.3动物试验和分组

1.3.1试验动物及分组35只清洁级雄性 SD大鼠，体重 200 g左右，购于广州中医药大学实验动物中心。饲养环境温度（20.0±1.0）℃，湿度 50%～60%，自由饮水进食。35只大鼠预饲1周后，分为空白对照组（C），C组灌胃生理盐水 2 mL/只；试验组共分4组，每组7只大鼠。试验组灌胃马拉硫磷700 mg/kg后，（1）T1：处理后15 min；（2）T2：处理后 30 min；（3）T3：处理后60 min；（4）T4：处理后120 min；采大鼠血浆、心脏、肝脏等，-20 ℃备用。

1.3.2样品处理移取5 mL血浆于50 mL聚丙烯离心管中，加入30 mL乙腈-正己烷（1 ∶1）溶液，涡旋振荡提取 30 min，6 000 r/min，离心5 min，上清液转入250 mL分液漏斗中，另用30 mL乙腈-正己烷（1 ∶1）提取残留物，合并提取液。用40 mL正己烷与40 mL饱和NaCl溶液萃取。静置分层后，收集正己烷层（无水硫酸钠干燥），旋转蒸发仪浓缩至 4 mL，再用乙腈提取3次，弃去正己烷层，并收集乙腈层，旋转蒸发仪干燥后0.5 mL正己烷定容，过0.45 μm滤膜后取20 μL进样。组织样品匀浆后，称取5 g样品匀浆液于50 mL聚丙烯离心管中，后续处理方法同上血浆前处理方法。

1.4统计处理

采用对映体分数EF值作为马拉硫磷手性对映体选择性变化的指标[7]，EF=E1/（E1+E2）。E1和E2分别表示第1个出峰的对映体与第2个出峰的对映体的峰面积。EF值的变化范围在0～1.0之间，EF=0.5表示外消旋体。所得到的EF值偏离外消旋体标样的EF值越远，表明马拉硫磷对映体在样本中的立体选择性行为越明显。本研究中E1代表R-构型，E2代表S-构型。

2结果与分析

2.1马拉硫磷的HPLC色谱分析

马拉硫磷经自制纤维素三苯甲酸酯（CDMPC）手性固定相色谱柱，8 min内分离成2个峰，经圆二色检测器[8-9]，确定2个对映体流出先后顺序为先流出的是右旋，后流出的是左旋。在0.3～151.0 μmol/L的范围内，2个对映体峰面积与浓度呈线性关系，相关系数为0.999 3、0.999 6。最低检测限为 81.2 nmol/L，检测灵敏度高。配制15.1 μmol/L的马拉硫磷测定的右旋、左旋对映体的日内、日间精密度分别为337%、521%和4.24%、5.53%，均在6%以内，精密度符合要求，测定方法可靠，可以作为定量的依据，结果见表1。马拉硫磷在大鼠血浆、心脏和肝脏等组织中的回收率分别为7375%～119.95%，结果见表2。endprint

3讨论

一般认为，有机磷农药中毒主要机理是抑制乙酰胆碱酯酶的活性，引起中枢神经调节功能紊乱、神经过分刺激、冲动不能休止，造成机体痉挛、瘫痪等一系列神经中毒症状，甚至死亡。

手性化合物对映体在代谢过程中的立体选择性表现在吸收、分布、代谢和消除的整个过程中，这种选择性来源于手性药物与生物体内的手性环境及内源性手性分子的相互作用。手性农药在体内，可能受酶系统或消化道菌丛的作用发生结构性生物转化。

本研究中，经口服灌胃外消旋马拉硫磷后，在大鼠体内表现出明显的立体选择性药代动力学行为和降解特征，用药后1 h内，2对映体在血浆中的浓度差异很大，EF值趋于1，表明S-构型在代谢过程中消失。造成这种现象最有可能的原因就是对映体发生了转化。在药物进入血液中后，由于某种酶的作用，马拉硫磷左旋体发生转化，迅速转化成对映体右旋体，相关机理还有待于进一步深入研究。

药物代谢可以从体内消除，也可进一步代谢。大多数代谢在肝中进行，也有在其他器官代谢。从各组织中EF含量可见，在心脏和肝脏组织中R-构型的含量也是一直高于S-构型的，随时间的增加EF值趋于稳定。由此可以推断出马拉硫磷的毒性与构型相关，且R-构型起主要作用。本结论也与一般认为有机磷杀虫活性与对动物的毒性相关，R-构型较S-构型具有更高的活性的结论相符[11]。本研究结果马拉硫磷对映体在大鼠血浆和组织中代谢存在明显的立体选择性，且R-构型较S-构型活性高，S-构型不稳定，易降解转化。

参考文献：

[1]Abdel R A，Dechkovska I M，Gold S B，et al. Neurological deficits induced by malathion，DEET，and permethrin，alone or in combination in adult rats[J]. Toxicol Environ Health A，2004，67：331-356.

[2]Betancourt M，Reséndiz A，Fierro E C R. Effect of two insecticides and two herbicides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semen analysis（CASA） in vitro[J]. Reproductive Toxicology，2006，22：508-512.

[3]Huisdea R E，kraak J C，Poppe H. Modification of silica with glucose for the separation of proteins by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography a，1990，508（2）：289-299.

[4]孟磊，郑先福，宁爱民，等. 纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性柱的制备及应用[J]. 河南科学，2005，23（3）：352-355.

[5]Uhe A M，Collier G R，Mclennan E A，et al. Quantitation of tryptophan and other plasma amino acids by automated pre-column O-phthaldialdehyde derivatization high-performance liquid chromatography：improved sample preparation[J]. J Chrom，1991，564：81-91.

[6]di Pierro D，Lazzarino G，Pastore F S，et al. Determination of boronophenylalanine in biological samples using precolumn O-phthalaldehyde derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry，2000，284（2）：301-306.

[7]Ulrich E M，Foreman W T. Complications with using ratios for environmental data：Comparing enantiomeric ratios（ERs）and enantiomer fractions（EFs）[J]. Chemosphere，2003，53：531-538.

[8]Berkm A E，Qu Inn dA. Thompson C M.interaction of acetylcholine sterase with the enantiomers of malathion and Iso malathion[J]. Chemical Research in Toxicology，1993，6：724-730.

[9]王鹏，王玉红，冯楠，等. 淀粉衍生物固定相对马拉硫磷和氟虫腈对映体的手性拆分[J]. 应用化学，2006，23（10）：1170-1172.

[10]Shafer T J，Meyer D A，Crofton K M. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecitides：critical review and future research needs[J]. Environmental Health Perspectives，2005，113（2）：123-136.

[11]周炳，赵美蓉，张安平，等. 马拉硫磷对映体对人成神经细胞瘤细胞生长影响的选择性差异[J]. 农药学学报，2007，9（3）：263-268.endprint

3讨论

一般认为，有机磷农药中毒主要机理是抑制乙酰胆碱酯酶的活性，引起中枢神经调节功能紊乱、神经过分刺激、冲动不能休止，造成机体痉挛、瘫痪等一系列神经中毒症状，甚至死亡。

手性化合物对映体在代谢过程中的立体选择性表现在吸收、分布、代谢和消除的整个过程中，这种选择性来源于手性药物与生物体内的手性环境及内源性手性分子的相互作用。手性农药在体内，可能受酶系统或消化道菌丛的作用发生结构性生物转化。

本研究中，经口服灌胃外消旋马拉硫磷后，在大鼠体内表现出明显的立体选择性药代动力学行为和降解特征，用药后1 h内，2对映体在血浆中的浓度差异很大，EF值趋于1，表明S-构型在代谢过程中消失。造成这种现象最有可能的原因就是对映体发生了转化。在药物进入血液中后，由于某种酶的作用，马拉硫磷左旋体发生转化，迅速转化成对映体右旋体，相关机理还有待于进一步深入研究。

药物代谢可以从体内消除，也可进一步代谢。大多数代谢在肝中进行，也有在其他器官代谢。从各组织中EF含量可见，在心脏和肝脏组织中R-构型的含量也是一直高于S-构型的，随时间的增加EF值趋于稳定。由此可以推断出马拉硫磷的毒性与构型相关，且R-构型起主要作用。本结论也与一般认为有机磷杀虫活性与对动物的毒性相关，R-构型较S-构型具有更高的活性的结论相符[11]。本研究结果马拉硫磷对映体在大鼠血浆和组织中代谢存在明显的立体选择性，且R-构型较S-构型活性高，S-构型不稳定，易降解转化。

参考文献：

[1]Abdel R A，Dechkovska I M，Gold S B，et al. Neurological deficits induced by malathion，DEET，and permethrin，alone or in combination in adult rats[J]. Toxicol Environ Health A，2004，67：331-356.

[2]Betancourt M，Reséndiz A，Fierro E C R. Effect of two insecticides and two herbicides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semen analysis（CASA） in vitro[J]. Reproductive Toxicology，2006，22：508-512.

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[4]孟磊，郑先福，宁爱民，等. 纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性柱的制备及应用[J]. 河南科学，2005，23（3）：352-355.

[5]Uhe A M，Collier G R，Mclennan E A，et al. Quantitation of tryptophan and other plasma amino acids by automated pre-column O-phthaldialdehyde derivatization high-performance liquid chromatography：improved sample preparation[J]. J Chrom，1991，564：81-91.

[6]di Pierro D，Lazzarino G，Pastore F S，et al. Determination of boronophenylalanine in biological samples using precolumn O-phthalaldehyde derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry，2000，284（2）：301-306.

[7]Ulrich E M，Foreman W T. Complications with using ratios for environmental data：Comparing enantiomeric ratios（ERs）and enantiomer fractions（EFs）[J]. Chemosphere，2003，53：531-538.

[8]Berkm A E，Qu Inn dA. Thompson C M.interaction of acetylcholine sterase with the enantiomers of malathion and Iso malathion[J]. Chemical Research in Toxicology，1993，6：724-730.

[9]王鹏，王玉红，冯楠，等. 淀粉衍生物固定相对马拉硫磷和氟虫腈对映体的手性拆分[J]. 应用化学，2006，23（10）：1170-1172.

[10]Shafer T J，Meyer D A，Crofton K M. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecitides：critical review and future research needs[J]. Environmental Health Perspectives，2005，113（2）：123-136.

[11]周炳，赵美蓉，张安平，等. 马拉硫磷对映体对人成神经细胞瘤细胞生长影响的选择性差异[J]. 农药学学报，2007，9（3）：263-268.endprint

3讨论

一般认为，有机磷农药中毒主要机理是抑制乙酰胆碱酯酶的活性，引起中枢神经调节功能紊乱、神经过分刺激、冲动不能休止，造成机体痉挛、瘫痪等一系列神经中毒症状，甚至死亡。

手性化合物对映体在代谢过程中的立体选择性表现在吸收、分布、代谢和消除的整个过程中，这种选择性来源于手性药物与生物体内的手性环境及内源性手性分子的相互作用。手性农药在体内，可能受酶系统或消化道菌丛的作用发生结构性生物转化。

本研究中，经口服灌胃外消旋马拉硫磷后，在大鼠体内表现出明显的立体选择性药代动力学行为和降解特征，用药后1 h内，2对映体在血浆中的浓度差异很大，EF值趋于1，表明S-构型在代谢过程中消失。造成这种现象最有可能的原因就是对映体发生了转化。在药物进入血液中后，由于某种酶的作用，马拉硫磷左旋体发生转化，迅速转化成对映体右旋体，相关机理还有待于进一步深入研究。

药物代谢可以从体内消除，也可进一步代谢。大多数代谢在肝中进行，也有在其他器官代谢。从各组织中EF含量可见，在心脏和肝脏组织中R-构型的含量也是一直高于S-构型的，随时间的增加EF值趋于稳定。由此可以推断出马拉硫磷的毒性与构型相关，且R-构型起主要作用。本结论也与一般认为有机磷杀虫活性与对动物的毒性相关，R-构型较S-构型具有更高的活性的结论相符[11]。本研究结果马拉硫磷对映体在大鼠血浆和组织中代谢存在明显的立体选择性，且R-构型较S-构型活性高，S-构型不稳定，易降解转化。

参考文献：

[1]Abdel R A，Dechkovska I M，Gold S B，et al. Neurological deficits induced by malathion，DEET，and permethrin，alone or in combination in adult rats[J]. Toxicol Environ Health A，2004，67：331-356.

[2]Betancourt M，Reséndiz A，Fierro E C R. Effect of two insecticides and two herbicides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semen analysis（CASA） in vitro[J]. Reproductive Toxicology，2006，22：508-512.

[3]Huisdea R E，kraak J C，Poppe H. Modification of silica with glucose for the separation of proteins by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography a，1990，508（2）：289-299.

[4]孟磊，郑先福，宁爱民，等. 纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性柱的制备及应用[J]. 河南科学，2005，23（3）：352-355.

[5]Uhe A M，Collier G R，Mclennan E A，et al. Quantitation of tryptophan and other plasma amino acids by automated pre-column O-phthaldialdehyde derivatization high-performance liquid chromatography：improved sample preparation[J]. J Chrom，1991，564：81-91.

[6]di Pierro D，Lazzarino G，Pastore F S，et al. Determination of boronophenylalanine in biological samples using precolumn O-phthalaldehyde derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry，2000，284（2）：301-306.

[7]Ulrich E M，Foreman W T. Complications with using ratios for environmental data：Comparing enantiomeric ratios（ERs）and enantiomer fractions（EFs）[J]. Chemosphere，2003，53：531-538.

[8]Berkm A E，Qu Inn dA. Thompson C M.interaction of acetylcholine sterase with the enantiomers of malathion and Iso malathion[J]. Chemical Research in Toxicology，1993，6：724-730.

[9]王鹏，王玉红，冯楠，等. 淀粉衍生物固定相对马拉硫磷和氟虫腈对映体的手性拆分[J]. 应用化学，2006，23（10）：1170-1172.

[10]Shafer T J，Meyer D A，Crofton K M. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecitides：critical review and future research needs[J]. Environmental Health Perspectives，2005，113（2）：123-136.

[11]周炳，赵美蓉，张安平，等. 马拉硫磷对映体对人成神经细胞瘤细胞生长影响的选择性差异[J]. 农药学学报，2007，9（3）：263-268.endprint