响应面法优化耐热植酸酶产生菌发酵培养基

陈璨　张菊　常云霞等

摘要：在单因素法初步优化试验基础上，进行了Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验以及响应面分析（采用Box-Behnken法）进一步优化了菌株zk1266的发酵产酶培养基，得到最佳培养基组分为：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化钾0.27%，氯化钠0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.005%，用此培养基对菌株进行培养，菌株所产耐热植酸酶酶活为141.26 U/mL。菌株产酶能力比优化前有了较大提高。

关键词：植酸酶；Plackett-Burman设计；Box-Behnken设计；响应曲面

中图分类号： Q939.9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金项目：周口师范学院青年科研基金（编号：2012QNA04）。

作者简介：陈璨（1985—），男，河南周口人，硕士，讲师，主要从事分子与微生物学研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陈龙，教授，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸盐水解成磷酸（或磷酸盐）、肌醇的一类酶[1-3]。因其可解决植酸带来的环境及营养问题，植酸酶已成为饲料、酶制剂及食品添加剂领域的研究热点[4-6]。植酸酶可代替饲料原料中所添加的大量无机磷（磷酸氢钙等），不仅可以解决我国磷资源供应不足的问题，还可以减少生产无机磷的工厂数量[7]。用添加植酸酶的饲料喂养动物可有效减少其粪便中的磷含量，进而可解决因磷含量过多导致的土壤板结及水质下降等问题，改善农村农田环境。工业制备植酸酶时，在高温制粒这一环节中，植酸酶的热稳定性较差，严重影响植酸酶的工业化生产，因此进行耐热植酸酶筛选显得十分重要。笔者所在试验室筛选到1株耐热植酸酶产生菌。本研究以响应面法优化其发酵培养基，提高其耐热植酸酶的活力，旨在为植酸酶工业化生产奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

菌株zk1266分离自农村堆肥。

1.2培养基

液体种子培养基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化钠005%，蒸馏水定容至100 mL，pH值自然。初始产酶发酵培养基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化钠0.05%，氯化钾005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，FeSO4·7H2O 0.01%，蒸馏水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活测定方法装液量100 mL，接种量6%，45 ℃ 180 r/min培养50 h后测酶活，每组做3个平行，结果取平均值。参照叶冰等的酶活测定方法[8]测定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman试验设计进行Plackett-Burman试验设计，筛选出对酶活影响显著的因子。装液量100 mL，接种量6%，45 ℃ 180 r/min培养50 h后测酶活，每组做3个平行，结果取平均值。

1.3.3最陡爬坡试验根据Plackett-Burman试验筛选出的显著因子效应大小，设计它们的步长，进行最陡爬坡试验，确定试验因素中心点，找到产酶活性最高的区域。参照“131”节的方法测酶活性。

1.3.4响应面分析采用Box-Behnken法，根据最陡爬坡试验确定的试验因素中心点设计响应面因素及水平。采用Minitab 15软件对数据进行分析，得到二次线性回归方程，分析各因素的主效应、交互效应，在一定水平范围内求最佳值，最后通过试验来验证模型的预测值与实际值是否吻合、模型是否合理。参照“1.3.1”节的方法测酶活性。

2结果与分析

2.1Plackett-Burman试验设计结果

采用Plackett-Burman设计，从6个影响因素中筛选出具有显著影响的因素。每个因素取2个水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化钾是影响显著的因素。

3结论

本研究表明，培养基最佳成分为：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化钾0.27%，氯化钠0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.005%，用此培养基对菌株进行培养，菌株所产耐热植酸酶酶活为141.26 U/mL。经过对产酶培养基进行优化后，菌株zk1266的发酵产酶活力有了较明显的提高。45 ℃下，本试验所用菌株zk1266能正常生长，若用其进行放大培养及进一步的工业生产，可以减少生产中污染杂菌的概率。

参考文献：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

[3]陈育如，刘友芬，郭月霞，等. 秸秆降解微生物在不同培养基中的产植酸酶特性[J]. 江苏农业科学，2008（2）：210-212.

[4]Cao L，Wang W M，Yang C T，et al. Application of microbial phytase in fish feed[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，40（4）：497-507.

[5]周建琴，刘菊香. 聚乙烯醇复合固定化植酸酶方法研究[J]. 中国酿造，2009（11）：112-115.

[6]董其国，徐稳，王恬. 不同剂量植酸酶对生长育肥猪生产性能和饲料养分利用率的影响[J]. 江苏农业科学，2010（4）：215-218.

[7]张莉，赵耘，王郡美. 植酸酶在饲料工业中的应用及其研究进展[J]. 畜牧兽医科技信息，2006（8）：7-9.

[8]叶冰，王运吉，张苓花. 植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵[J]. 大连轻工业学院学报，2002，21（3）：193-196.endprint

摘要：在单因素法初步优化试验基础上，进行了Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验以及响应面分析（采用Box-Behnken法）进一步优化了菌株zk1266的发酵产酶培养基，得到最佳培养基组分为：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化钾0.27%，氯化钠0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.005%，用此培养基对菌株进行培养，菌株所产耐热植酸酶酶活为141.26 U/mL。菌株产酶能力比优化前有了较大提高。

关键词：植酸酶；Plackett-Burman设计；Box-Behnken设计；响应曲面

中图分类号： Q939.9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金项目：周口师范学院青年科研基金（编号：2012QNA04）。

作者简介：陈璨（1985—），男，河南周口人，硕士，讲师，主要从事分子与微生物学研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陈龙，教授，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸盐水解成磷酸（或磷酸盐）、肌醇的一类酶[1-3]。因其可解决植酸带来的环境及营养问题，植酸酶已成为饲料、酶制剂及食品添加剂领域的研究热点[4-6]。植酸酶可代替饲料原料中所添加的大量无机磷（磷酸氢钙等），不仅可以解决我国磷资源供应不足的问题，还可以减少生产无机磷的工厂数量[7]。用添加植酸酶的饲料喂养动物可有效减少其粪便中的磷含量，进而可解决因磷含量过多导致的土壤板结及水质下降等问题，改善农村农田环境。工业制备植酸酶时，在高温制粒这一环节中，植酸酶的热稳定性较差，严重影响植酸酶的工业化生产，因此进行耐热植酸酶筛选显得十分重要。笔者所在试验室筛选到1株耐热植酸酶产生菌。本研究以响应面法优化其发酵培养基，提高其耐热植酸酶的活力，旨在为植酸酶工业化生产奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

菌株zk1266分离自农村堆肥。

1.2培养基

液体种子培养基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化钠005%，蒸馏水定容至100 mL，pH值自然。初始产酶发酵培养基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化钠0.05%，氯化钾005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，FeSO4·7H2O 0.01%，蒸馏水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活测定方法装液量100 mL，接种量6%，45 ℃ 180 r/min培养50 h后测酶活，每组做3个平行，结果取平均值。参照叶冰等的酶活测定方法[8]测定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman试验设计进行Plackett-Burman试验设计，筛选出对酶活影响显著的因子。装液量100 mL，接种量6%，45 ℃ 180 r/min培养50 h后测酶活，每组做3个平行，结果取平均值。

1.3.3最陡爬坡试验根据Plackett-Burman试验筛选出的显著因子效应大小，设计它们的步长，进行最陡爬坡试验，确定试验因素中心点，找到产酶活性最高的区域。参照“131”节的方法测酶活性。

1.3.4响应面分析采用Box-Behnken法，根据最陡爬坡试验确定的试验因素中心点设计响应面因素及水平。采用Minitab 15软件对数据进行分析，得到二次线性回归方程，分析各因素的主效应、交互效应，在一定水平范围内求最佳值，最后通过试验来验证模型的预测值与实际值是否吻合、模型是否合理。参照“1.3.1”节的方法测酶活性。

2结果与分析

2.1Plackett-Burman试验设计结果

采用Plackett-Burman设计，从6个影响因素中筛选出具有显著影响的因素。每个因素取2个水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化钾是影响显著的因素。

3结论

本研究表明，培养基最佳成分为：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化钾0.27%，氯化钠0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.005%，用此培养基对菌株进行培养，菌株所产耐热植酸酶酶活为141.26 U/mL。经过对产酶培养基进行优化后，菌株zk1266的发酵产酶活力有了较明显的提高。45 ℃下，本试验所用菌株zk1266能正常生长，若用其进行放大培养及进一步的工业生产，可以减少生产中污染杂菌的概率。

参考文献：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

[3]陈育如，刘友芬，郭月霞，等. 秸秆降解微生物在不同培养基中的产植酸酶特性[J]. 江苏农业科学，2008（2）：210-212.

[4]Cao L，Wang W M，Yang C T，et al. Application of microbial phytase in fish feed[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，40（4）：497-507.

[5]周建琴，刘菊香. 聚乙烯醇复合固定化植酸酶方法研究[J]. 中国酿造，2009（11）：112-115.

[6]董其国，徐稳，王恬. 不同剂量植酸酶对生长育肥猪生产性能和饲料养分利用率的影响[J]. 江苏农业科学，2010（4）：215-218.

[7]张莉，赵耘，王郡美. 植酸酶在饲料工业中的应用及其研究进展[J]. 畜牧兽医科技信息，2006（8）：7-9.

[8]叶冰，王运吉，张苓花. 植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵[J]. 大连轻工业学院学报，2002，21（3）：193-196.endprint

摘要：在单因素法初步优化试验基础上，进行了Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验以及响应面分析（采用Box-Behnken法）进一步优化了菌株zk1266的发酵产酶培养基，得到最佳培养基组分为：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化钾0.27%，氯化钠0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.005%，用此培养基对菌株进行培养，菌株所产耐热植酸酶酶活为141.26 U/mL。菌株产酶能力比优化前有了较大提高。

关键词：植酸酶；Plackett-Burman设计；Box-Behnken设计；响应曲面

中图分类号： Q939.9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金项目：周口师范学院青年科研基金（编号：2012QNA04）。

作者简介：陈璨（1985—），男，河南周口人，硕士，讲师，主要从事分子与微生物学研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陈龙，教授，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸盐水解成磷酸（或磷酸盐）、肌醇的一类酶[1-3]。因其可解决植酸带来的环境及营养问题，植酸酶已成为饲料、酶制剂及食品添加剂领域的研究热点[4-6]。植酸酶可代替饲料原料中所添加的大量无机磷（磷酸氢钙等），不仅可以解决我国磷资源供应不足的问题，还可以减少生产无机磷的工厂数量[7]。用添加植酸酶的饲料喂养动物可有效减少其粪便中的磷含量，进而可解决因磷含量过多导致的土壤板结及水质下降等问题，改善农村农田环境。工业制备植酸酶时，在高温制粒这一环节中，植酸酶的热稳定性较差，严重影响植酸酶的工业化生产，因此进行耐热植酸酶筛选显得十分重要。笔者所在试验室筛选到1株耐热植酸酶产生菌。本研究以响应面法优化其发酵培养基，提高其耐热植酸酶的活力，旨在为植酸酶工业化生产奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

菌株zk1266分离自农村堆肥。

1.2培养基

液体种子培养基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化钠005%，蒸馏水定容至100 mL，pH值自然。初始产酶发酵培养基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化钠0.05%，氯化钾005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，FeSO4·7H2O 0.01%，蒸馏水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活测定方法装液量100 mL，接种量6%，45 ℃ 180 r/min培养50 h后测酶活，每组做3个平行，结果取平均值。参照叶冰等的酶活测定方法[8]测定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman试验设计进行Plackett-Burman试验设计，筛选出对酶活影响显著的因子。装液量100 mL，接种量6%，45 ℃ 180 r/min培养50 h后测酶活，每组做3个平行，结果取平均值。

1.3.3最陡爬坡试验根据Plackett-Burman试验筛选出的显著因子效应大小，设计它们的步长，进行最陡爬坡试验，确定试验因素中心点，找到产酶活性最高的区域。参照“131”节的方法测酶活性。

1.3.4响应面分析采用Box-Behnken法，根据最陡爬坡试验确定的试验因素中心点设计响应面因素及水平。采用Minitab 15软件对数据进行分析，得到二次线性回归方程，分析各因素的主效应、交互效应，在一定水平范围内求最佳值，最后通过试验来验证模型的预测值与实际值是否吻合、模型是否合理。参照“1.3.1”节的方法测酶活性。

2结果与分析

2.1Plackett-Burman试验设计结果

采用Plackett-Burman设计，从6个影响因素中筛选出具有显著影响的因素。每个因素取2个水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化钾是影响显著的因素。

3结论

本研究表明，培养基最佳成分为：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化钾0.27%，氯化钠0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.005%，用此培养基对菌株进行培养，菌株所产耐热植酸酶酶活为141.26 U/mL。经过对产酶培养基进行优化后，菌株zk1266的发酵产酶活力有了较明显的提高。45 ℃下，本试验所用菌株zk1266能正常生长，若用其进行放大培养及进一步的工业生产，可以减少生产中污染杂菌的概率。

参考文献：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

[3]陈育如，刘友芬，郭月霞，等. 秸秆降解微生物在不同培养基中的产植酸酶特性[J]. 江苏农业科学，2008（2）：210-212.

[4]Cao L，Wang W M，Yang C T，et al. Application of microbial phytase in fish feed[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，40（4）：497-507.

[5]周建琴，刘菊香. 聚乙烯醇复合固定化植酸酶方法研究[J]. 中国酿造，2009（11）：112-115.

[6]董其国，徐稳，王恬. 不同剂量植酸酶对生长育肥猪生产性能和饲料养分利用率的影响[J]. 江苏农业科学，2010（4）：215-218.

[7]张莉，赵耘，王郡美. 植酸酶在饲料工业中的应用及其研究进展[J]. 畜牧兽医科技信息，2006（8）：7-9.

[8]叶冰，王运吉，张苓花. 植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵[J]. 大连轻工业学院学报，2002，21（3）：193-196.endprint