微生物产木聚糖酶研究进展

时间：2024-05-22

郄卫那　张兰英　何健等

摘要：木聚糖酶是生物技术领域的研究热点。介绍了木聚糖酶的分类、作用机理、高产菌株的种类及获得、工业应用等，以期为指导木聚糖酶工业化生产与应用建立基础。

关键词：木聚糖酶；功能分类；作用机理；高产菌株；工业化应用

中图分类号： TS201.2+5；Q556+.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0387-04

收稿日期：2013-10-22

作者简介：郄卫那（1986—），女，河北石家庄人，硕士研究生，从事环境微生物与环境工程研究。E-mail：woniubeibao@gmail.com。

通信作者：贺芹，讲师，主要从事环境微生物与环境工程研究。E-mail：qhe@njau.edu.cn。我国是农业大国，玉米、小麦、大麦、高粱等作物的木质纤维素类原料提供的大量非淀粉糖被广泛应用于能源、制浆、造纸业、纺织业等行业。木聚糖是双子叶植物次生细胞壁中最主要的半纤维素，木聚糖水解研究对于木质纤维素原料利用具有重要的意义。然而，由于植物细胞壁的结构复杂性导致半纤维素或木聚糖难以被直接工业化利用，一般要先采用物理、化学或生物手段将多糖结构降解为可利用单糖。微生物产生的木聚糖水解酶是木聚糖降解酶系中最关键的酶，可将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖及少量其他单糖[1]。木聚糖酶生物来源广泛，在各种真菌、放线菌、细菌中均有发现。目前，国际上关于木聚糖酶的研究主要集中在木聚糖酶发酵诱导与调控机理、酶基因分子的克隆与表达、酶的纯化鉴定等方面。国内关于木聚糖酶的研究侧重于产木聚糖酶菌株的筛选与驯化、工程菌的构建、培养条件优化、酶学性质以及酶的纯化等方面。

1木聚糖与木聚糖酶

木聚糖（xylan）广泛存在于自然界，是植物细胞壁的主要组成成分之一，其含量通常占高等植物细胞干重的15%～35%，在自然界中较为丰富。木聚糖在细胞壁中起填充、黏合作用，在保护纤维素结构的整体性以及防止纤维降解等方面具有重要作用[2]。木聚糖是由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等构成的高分子聚合物，这种结构决定了木聚糖的难降解性。木聚糖酶（xylanase）指可将木聚糖催化水解为低聚木糖或木糖的一类复合酶系，包括内切β-木聚糖酶（endoxylanase）、外切β-木聚糖酶（exoxylanase）、β-木二糖苷酶等。通常情况下，细菌可产生酸、碱2种木聚糖酶，真菌一般只产低分子量的碱性木聚糖酶，但真菌所产酶活相对较高。由于木聚糖结构的复杂性，不同生物来源的木聚糖酶大多数只含有1个亚基，分子量范围为8～145 ku，最适反应pH值为4～7，最适反应温度为40～60 ℃。水解植物细胞壁的酶都有使可溶性水解酶聚集在不溶多糖上的碳水化合物结合部件（CDM）。木聚糖酶的CDM包括纤维素结合区（CBD）、木聚糖结合区（XBD）。研究显示，木聚糖酶中CBD结构域要远多于XBD，这可能与植物细胞壁的组成有关。纤维素是其中普遍存在且含量最高、分子结构变化幅度较小的多糖。木聚糖与纤维素共存决定了CBD与纤维素结合之后，木聚糖酶可最大限度地接近并降解木聚糖[3]。

2木聚糖酶的分类

2.1根据同源性、疏水簇分类

根据糖苷水解酶催化结构域的氨基酸同源性以及疏水簇分析，可将目前已知的糖苷水解酶分为58个家族。通常情况下木聚糖酶只有1个催化结构域，归为多糖代谢酶中的第10（F）、第11（G）2大家族。在密码子偏好性方面，第10（F）家族的木聚糖酶基密码子以“a”碱基为主，第11（G）家族以“g/c”碱基为主[4]。这2个家族酶催化区的氨基酸序列与催化基团的周围序列基本无同源性，表明这2个家族来源于不同的祖先基因，且在折叠方式上有很大差异。F/10家族木聚糖酶相对分子质量大于30，为酸性蛋白，通常含有269～809个氨基酸残基。酶的空间结构呈“碗状”，主要由α-螺旋、β-折叠片重复出现构成上面略大下面较小的形状，其催化部位位于碗底近碳端狭窄部位的深沟中[5]。G/11木聚糖酶多为单结构域，相对分子量小于30，含有182～234个氨基酸残基，其三级结构是由2个反相平行的β折叠片层扭曲成近90°，再加上1个α-螺旋使整个酶的空间结构呈“右手半握状”，其催化部位位于半握“手掌”与“手指”之间的长槽内[6]。F/10家族的木聚糖酶在耐酸、耐高温、耐碱等方面更具优越性，最适作用温度为60～80 ℃，催化产物中单糖较多。G/11家族通常为碱性蛋白，对木聚糖有很高的特异性，最适作用温度为50～60 ℃，催化产物多为寡聚糖。

2.2根据底物特异性分类

根据对酶解反应对象偏好性的不同，其催化特性特点又可细分为作用底物、糖苷键、基团的特异性。有的木聚糖酶可以任意切割非取代木糖残基，有的木聚糖酶则受酶切位点相邻取代基的影响。有的木聚糖酶只能水解木聚糖主链，如某些黑曲霉产生的木聚糖酶；有的木聚糖酶可水解主链、支链。根据底物组成的不同又可将木聚糖酶进一步分为特异性酶、交叉特异性酶。前者只能分解木聚糖β-1，4糖苷键，后者除此之外还可分解纤维素的β-1，4糖苷键，是双功能酶。双功能酶一般是指多肽链同时具有2种水解活性酶蛋白，可催化完成2个不同的生物反应过程，往往涉及数目巨大的中间体酶蛋白[7]。相较单功能酶系，双功能酶系具有快速、有效催化反应的特性。双功能木聚糖酶的产生主要是编码功能相关蛋白的基因在进化选择压力下发生融合所致，这种融合进化对生物体的共存有着重要的意义[8]。一方面，位于同一条多肽链上的功能相关基因可共用一套调控原件；另一方面，活性区域空间位置的拉近以及相互关联的增强均可对其他结构域产生直接影响[9]。研究表明，双功能酶系有不同家族的木聚糖酶系、木聚糖酶和纤维素酶系、木聚糖酶和葡聚糖酶系以及木聚糖和其他辅酶构成的酶系等。

3木聚糖酶的催化作用

3.1木聚糖酶的作用方式endprint

木聚糖需要在内切木聚糖酶、外切木聚糖酶以及作用于支链的糖苷键酶等多种酶的共同作用下才能完全降解。降解不同的木聚糖底物，所需要的木聚糖降解酶系也较复杂，常见酶系的组成及作用特点见表1。表1木聚糖降解酶系组成及作用特点

木聚糖酶降解酶系作用特点内切木聚糖酶β-1，4-木糖苷酶降解主链骨架，降低聚合度，主要生成低聚木糖外切木聚糖酶β-1，4-葡萄糖苷酶进一步降解低聚木糖，从还原末端释放木糖β-1，4-甘露糖苷酶侧链水解酶α-L-阿拉伯糖苷酶降解支链，加速低聚木糖的产生α-L-葡萄糖醛酸苷酶α-D-半乳糖苷酶酯酶乙酰木聚糖酯酶

降解木聚糖过程中，外切酶与内切酶相互促进，加速了木聚糖的降解、催化进程。内切酶主要作用于木聚糖主链内部的β-1，4糖苷键，将大的木聚糖主链切割成较小的聚合度较低的木糖，外切酶则把得到的低聚木糖进一步降解为单糖。从作用位置来看，内切酶的作用速度要高于外切酶；但从分解效率上看，内切酶可有效降解木聚糖，能够降解80%的木聚糖，而外切酶只能以不到50%的比例作用于低聚木糖或木聚糖支链；从作用后的产物看，内切木聚糖酶的产物主要是寡糖等低聚糖，外切木聚糖酶则以木糖为主[10]。对于α-L-阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸酶等，可以从非还原端作用于木聚糖支链中的阿拉伯聚糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯半乳糖等之间的糖苷键，乙酰木聚糖酯酶破坏羧酸残基与木聚糖之间的联系，从而提高木聚糖的溶解性、降解速度，绝大部分的支链水解酶能够进一步激活主链酶的活性，加速酶解反应的进行。微生物在水解木聚糖时，往往是各种酶相互调节、协同作用，使木聚糖完全降解[11]。

3.2木聚糖酶的作用机理

早在20世纪90年代，人们便开始了对木聚糖酶催化机理的研究。研究发现，经修饰后的酸性氨基酸在木聚糖酶催化反应中起重要作用[12]。在这个反应中，第1个氨基酸作用于糖苷键，使其中的氧原子得到电子；第2个氨基酸与含氧的正碳原子中间产物或水分子形成羟基亲和剂。处于活化状态的氨基酸羟基把带正电的质子结合到糖苷键上使其不能发挥作用，同时通过正碳离子与得到电子的氨基酸形成共价键，带正电的质子转移到亲核基团上，水分子的羟基转移到正碳离子上，完成水解过程[13]。

3.3木聚糖在糖平台构建中的关键催化作用

糖平台是指碳水化合物含量为75%以上的生物质。这些碳水化合物既是糖平台中间体，同时又可作为进一步转化的基础物质。糖平台技术基于生物化学的转化过程，其重点在于发酵、转化从生物质原料中提取的糖分，如纤维素组分来源的葡萄糖，木聚糖组分来源的木糖、半乳糖、阿拉伯糖等。糖平台技术可以生产能源、燃料以及生物基产品，也可以生产很多能形成谱系产品的化学品[14]。工业上一般利用蔗糖与淀粉作为直接可发酵糖源。纤维素可以转化为可发酵糖，由于其具有可再生性，纤维素糖平台研究日益引起人们的注意。但是纤维素并不能直接作为发酵糖源，一般要通过预处理技术实现多聚糖的降解与分离。目前利用这种原料最有前景的方法是：预处理木质纤维素后，纤维素变得更易被酶作用，再用酶水解纤维素成分。目前人们普遍采用生物、物理、化学方法首先脱除其中的半纤维素组分，如利用蒸汽爆破、木聚糖酶或稀酸水解等方法降解木聚糖成分，因此木聚糖酶的制备与利用成为其中一个重要的步骤。木聚糖酶可以分解秸秆类物质获得低聚木糖，木糖、阿拉伯糖等五碳糖以及甘露糖、半乳糖、葡萄糖等六碳糖，可作为发酵工业、食品工业等领域重要的糖来源。

4木聚糖酶产生菌株研究进展

4.1木聚糖酶产生菌株的种类

早在20世纪50年代，Srensen就对土壤中的木聚糖酶进行了研究[15]。我国对木聚糖酶的研究起步较晚，1980年左右，曾宇成等首次从海枣曲霉中纯化得到了4种木聚糖酶[16]。目前国内外报道的产木聚糖酶微生物涉及细菌、真菌、放线菌、酵母等。大多数产木聚糖酶细菌适宜生长温度比真菌高，且细菌的热稳定性要高于真菌。细菌性木聚糖酶中含有增加热稳定性的结构域，该结构域可与木聚糖酶催化结构域紧密相连，同时含有较多的大体积、且可通过增加折叠分子的紧密性来增加热稳定性的疏水性芳香族氨基酸。细菌产木聚糖酶的pH值稳定且范围广，且内切木聚糖酶含量较高，可较快分解木聚糖。目前产木聚糖酶的霉菌主要有黑曲霉、青霉菌、里氏木霉、绿色木霉等。霉菌木聚糖酶的表达量往往高于细菌、酵母，且一般为胞外酶，发酵后易于分离纯化，因此在木聚糖酶工业生产中，一般采用霉菌[17]。但霉菌所产酶系较为复杂，常伴随高活性纤维素酶的产生。表2列出了近几年木聚糖酶产生菌株的产酶情况。

4.2木聚糖酶高产菌株的选育方法

4.2.1自然筛选土壤是取之不尽的菌种宝库，长期堆放的秸秆、稻草、树叶等木聚糖含量较高的土壤都可分离到相对高表2部分产木聚糖酶的真菌

菌株培养方式底物酶活Paecilomyces themophila J18 固态发酵麦秸18 580 U/g 底物[18]Aspergillus fischeri Fxn 1固态发酵麦麸1 024 U/g底物[19]Aspergillus foetidus MTCC 4898液态发酵1%木聚糖210 U/mL 发酵液[20]Pleurotus florida固态发酵预处理稻秸105.9 U/g底物[21]Bacillus pumilus ASH液态发酵2%麦麸5 407 U/mL发酵液[22]Burkholderia sp. DMAX固态发酵乙醇废醪5 200～5 600 U/g底物[23]Streptomyces cyaneus SN32液态发酵麦麸、蛋白胨720 U/mL 发酵液[24]Cryptococcus adeliae 液态发酵2.4%木聚糖24 U/mL发酵液[25]

效的木聚糖酶生产菌株。菌种初筛一般采用刚果红透明圈法，利用菌株在刚果红平板上形成的的淡红色圈来判断木聚糖酶活性大小。由于木聚糖溶解性较差，因此也可以直接在平板培养基中加入木聚糖，再根据菌落周围是否出现透明水解圈及透明圈的大小来筛选产酶菌株。在初筛基础上，通常利用DNS酶活测定法进行复筛，从而获得产酶量高的菌种。endprint

4.2.2诱变育种从土壤中筛选出的绝大部分野生型菌株产酶活力较低，不能直接用于工业生产，要对菌株进行选育改造，以获得高产菌株。诱变育种是微生物常用的改良方法，可采用物理诱变或化学诱变来提高其产酶能力。离子束诱变育种是一种新型的诱变方式，目前已实现了对多种菌株的改造，该方法利用离子注入设备产生离子束作为诱变源，实现生物体遗传物质的永久改变。如维生素C的生产量在国内外创造了新纪录，就是利用离子诱变菌种取得的[26]。Li等利用低能氮离子获得了黑曲霉突变菌株Aspergillus niger A3 N212，使其最适作用温度以及产生的木聚糖酶酶活比出发菌株分别提高了2 ℃和98%[27]。

4.2.3基因重组技术基因重组技术在菌种改良方面具有极大潜力，目前基因重组常用的蛋白质表达系统包括原核表达系统、真核表达系统。原核表达系统是无须修饰只表达翻译后即可获得产物的首选系统，简单易行，所获得的微生物产量高，适用于大规模生产。包怡红等把高产菌株BP51克隆得到的木聚糖酶基因xynA在芽孢杆菌中构建重组质粒，再将质粒通过原生质体转化方法转入短小芽孢杆菌中获得重组菌株，产酶活力约提高20倍[28]。真核表达系统常采用的是酵母表达系统。与原核表达系统相比，酵母表达系统克服了蛋白翻译后修饰、复性困难且效率低、不易纯化等缺陷，具有生长快速、培养基廉价、操作简单可行等特点，但也存在启动子作用效果不明显、产率低、质粒稳定性差等缺点。

4.2.4蛋白质工程技术蛋白质工程是指通过修饰蛋白质的基因或改变其结构来获得具有新特性的蛋白质，目前已成为学者们研究酶性质（主要是热稳定性）的主要手段，常用方法有定点突变、同序概念半推理设计、木聚糖酶分子的化学修饰、杂合酶构建、定向进化等[29]。Baumann等采用易错PCR和定点突变技术获得了新型耐高温嗜碱芽孢杆菌（Bacillus halodurans）突变株，该突变株产生的木聚糖酶在75 ℃下仍具有较高的活性[30]。

5木聚糖酶的应用

木聚糖酶的工业化应用始于20世纪80年代，最初应用于饲料，而后扩展到食品、纺织、造纸、医药等行业。近年来，关于木聚糖酶在工业上的应用每年都有大量的文献报道。根据木聚糖酶在工业应用上的主要目标，木聚糖酶的工业应用主要可分为两个方面：以去除木聚糖成分或得到较纯品为目标的饲料工业、造纸工业、纺织工业等以及以获得可利用糖或构建糖平台为主要目的的食品工业、发酵工业、医药行业等。

5.1以除杂为主要目标的工业应用

5.1.1造纸工业造纸工业中一道重要的工艺是制浆，制浆的主要目的是去除原材料中的木聚糖、木质素等成分，获得高纯度纤维素。木聚糖通过化学键直接连在纤维素、木质素上，形成难降解的木质素-木聚糖复合体（LCC），导致木质素难以被去除、漂白。木聚糖酶能够水解LCC，实现木聚糖的深入水解，使木聚糖降解溶出，加快纸浆中木质素的释放，提高纸浆强度[31]。目前已有一些关于嗜极性细菌或真菌在纸浆漂白中应用的报道。要特别说明的是，造纸工业中选用的木聚糖酶应具有分子量较小、不能同时降解纤维素的特点。原因是小分子量的木聚糖酶有利于在纸浆中溶解、扩散，不具纤维素酶活的特点可避免降解纸浆中的纤维，影响成浆的质量[32]。木聚糖酶的使用减少了因漂白纸浆中残余木质素成分所消耗的大量漂白剂。将木聚糖酶、臭氧、过氧化氢等与漂白剂组合使用，可最大限度减少漂白过程中致癌物的产生，减少废水排放与环境污染。废纸脱墨是指利用化学药剂，对使用过的纤维进行降解回收的过程。通过在脱墨中加入木聚糖酶，或者与其他复合酶一起使用，在一定条件下利用生物制剂可大大增加对纤维素的降解率，提高产率，减少环境污染。

5.1.2饲料工业动物饲料中的半纤维素成分几乎不能被单胃动物吸收利用，因为这类动物的体内没有相应的消化酶。饲料中往往需要添加相应的酶以降解难以被动物直接利用吸收的成分，如纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶等用于降解非淀粉类多糖，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等用于补充动物的内源酶。在饲料中加入木聚糖酶，可降低肠道内容物的黏性，加快内源消化酶的扩散速率。另外，木聚糖酶还可通过降解作用破坏植物的细胞壁结构，使植物性饲料中的营养物质释放出来。木聚糖酶可减少有害菌繁殖，改善肠道形态结构，从而抑制厌氧微生物的生长，降低肠道疾病的发生率。通过调节畜禽的胃肠道环境从而提高其免疫力，减少排泄物对环境的危害，提高经济效益[33]。在饲料中添加木聚糖酶不仅可以提高能量、氨基酸、脂肪等营养物质的消化率，而且在非反刍动物饲料中引入来源丰富的小麦等农作物秸秆及副产物，可以极大地缓解我国饲料原料短缺的问题。

5.2以降糖为主要目标的工业应用

以降解木聚糖、获得低聚木糖或木糖为目的的行业主要集中于发酵工业如食品行业等。木聚糖水解产生的低聚木糖、木糖作为双歧因子、功能糖，可以激活双歧杆菌的活性、改善胃肠道环境、增进肠胃蠕动、帮助消化、增强人体免疫力；还可促进人体对钙质的吸收、增强身体素质、减少疾病等；也可作为低能量甜味剂及糖尿病人的食用糖源。

5.2.1木聚糖酶在面粉中的应用小麦面粉中非淀粉多糖的主要成分是阿拉伯木聚糖，其中水不溶性阿拉伯木聚糖约占70%～80%。该物质对面团的内部结构及面制品的口感有显著影响。Uysal等研究发现，在面粉中添加适量的木聚糖酶能使不溶性阿拉伯木聚糖增溶，提高面团的柔软度、拉力，从而改善面制品的品质、硬度[34]。对于面包等烘焙食品，木聚糖酶可水解谷物面包粉中的木聚糖至单糖，使水在面粉、蛋白两相中重新分布，从而改善面包的质地、结构、松软度、保质期。除此之外，木糖等单糖与蛋白在烘培过程中更容易发生美拉德反应，增加食品的风味与口感。

5.2.2木聚糖酶在饮品等方面的应用木聚糖酶能够降解果蔬汁、啤酒中的一些多糖类物质。果蔬汁的生产包括榨取、澄清、稳定等3个主要过程。果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶等水解酶的组合使用不仅能提高果汁稳定性，而且有助于饮料与固含物离心，从而快速降低果汁黏度，防止形成烟雾状沉淀。木糖、阿拉伯糖等可以使果汁具有独特的口感。酿酒工业中，原料含有水溶性较差的非淀粉多糖类物质，木聚糖酶主要被用于破坏原料细胞的结构，加快淀粉酶的催化作用，提高发酵效率，增加乙醇产率。同时还可水解引起饮料呈现不透明状态的多糖，降低发酵液的黏度，提高产品清澈度，产生的单糖能促进乙醇发酵，提高酒品质量及生产效率。木聚糖酶可以作用于咖啡豆中的木聚糖等，减少产品黏度。同时，食用木聚糖酶水解木聚糖产生的低聚木糖后不会引起人体内血糖较大幅度的波动，所以可代替白糖制作成甜味剂，还可用作食品工业中的黏稠剂、脂肪替代品。endprint

6展望

木聚糖酶不仅可以降解农业废弃物如秸秆等，同时可以变废为宝，为工业领域提供更为广泛的原料来源及中间化学品。因而，获得低成本的工业化木聚糖酶，对于降解半纤维素、获得低分子量单糖或寡糖产品、构建糖平台非常关键。

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